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Determinación de la concentración letal media de recubrimientos biodegradables de
quitosano y compuestos bioactivos en nauplios de Artemia salina Leach
Median lethal concentration of biodegradable chitosan coatings and bioactive compounds in
Artemia Salina Leach nauplii
Yeny M. Acosptupa–Quispe1*; Violeta E. Zamalloa–Acurio 2, Alicia Claveli,–Jarandilla 3,
Indira Monterola–Jururo2 & Jonyer H. Zapata–Callañaupa2
1Escuela Profesional de Física, 2Escuela Profesional de Biología; 3Escuela Profesional de Química, Facultad de Ciencias.
Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco, Av. de la Cultura 733, Cusco- Perú
* Autor corresponsal: Yeny M. Acostupa–Quispe, yeny.accostupa@unsaac.edu.pe
RESUMEN
Se determinó la concentración letal media para cada formulación desarrollada de recubrimientos biodegradables de quitosano al
1% con aditivos a diferentes concentraciones de aceite esencial de hierba luisa o aceite esencial de limón y glicerol, dichas
formulaciones fueron desarrolladas con miras a ser usados sobre frutos de fresa. En las formulaciones de los recubrimientos
biodegradables se evaluó la actividad tóxica usando como organismo de prueba Nauplios de Artemia Salina Leach, los resultados
de mortalidad sirvieron para determinar la concentración letal media en las formulaciones, para ello se usó la librería ‘drc’ del
programa R, dando por resultado que al 0.25% de aceite esencial de hierba luisa o limón y al 0.3% de glicerol la formulación es
relativamente inocua. Del análisis de su comportamiento y de los resultados del ANOVA se obtuvo que la adición de glicerol actúa
positivamente sobre la concentración letal media y que la adición de aceite esencial actúa positivamente hasta 0.25% para después
actuar negativamente. Se concluyó que las formulaciones desarrolladas para los ensayos con aceite esencial de hierba luisa o de
limón están catalogadas como ligeramente tóxica, prácticamente no toxica o relativamente inocuo; la formulación 1 de
recubrimientos biodegradables es relativamente inocuo sea con aceite esencial de hierba luisa o de limón; los ensayos con
incorporación de aceite esencial de limón presentan mayor actividad tóxica que las formulaciones en los ensayos con incorporación
de aceite esencial de hierba luisa.
Palabras claves: Recubrimientos, biodegradables, concentración letal media.
ABSTRACT
The mean lethal concentration was determined for each formulation developed of biodegradable 1% chitosan coatings with
additives at different concentrations of lemon verbena essential oil or lemon essential oil and glycerol, these formulations were
developed with a view to being used on strawberry fruits. In the formulations of the biodegradable coatings, the toxic activity was
evaluated using as test organism Nauplius from Artemia Salina Leach, the mortality results were used to determine the mean lethal
concentration in the formulations, for this the 'drc' library of the R program was used, resulting in that 0.25% lemon verbena
essential oil and 0.3% glycerol the formulation is relatively harmless. From the analysis of its behavior and the results of the
ANOVA, it was obtained that the addition of glycerol acts positively on the mean lethal concentration and that the addition of
essential oil acts positively up to 0.25% and then acts negatively. It was concluded that the formulations developed for the tests
with lemon verbena or lemon essential oil are classified as slightly toxic, practically non-toxic or relatively harmless; formulation
1 of biodegradable coatings is relatively harmless with either lemon verbena or lemon essential oil; the tests with the incorporation
of lemon essential oil show higher toxic activity than the formulations in the tests with the incorporation of lemon verbena essential
oil.
Keywords: Coatings, biodegradable, medium lethal concentration.
INTRODUCCIÓN
La toxicidad tiene un papel primordial al analizar si el uso
del recubrimiento biodegradable R.B. puede ser o no tóxico
para el organismo, por tanto el presente estudio tuvo como
objetivo evaluar la toxicidad de las formulaciones de R.B.,
determinar cuál de los ensayos con aceite esencial de hierba
luisa (AEHL) o con aceite esencial de limón (AEL) presentan
menor actividad tóxica y determinar que formulaciones de
recubrimientos biodegradables no tienen actividad tóxica para
ser usados como recubrimientos en frutos de fresa y poder
extender el tiempo de vida postcosecha generando menor
pérdida económica. La importancia de la investigación radica
también que el proyecto Sierra y Selva Exportadora ha
promovido la producción de fresas en el Valle Sagrado de los
Incas (La República, 2017) de manera sostenible que generan
ingresos autónomos en hogares rurales con economías de
subsistencia de comunidades de Coya - Calca, en Cusco
(Plataforma digital única del Estado Peruano, 2020). Así
también se espera que los resultados de esta investigación
contribuyan al desarrollo de otras formulaciones que puedan ser
de interés en la conservación de otros alimentos.
Los R.B. es una técnica no invasiva al recubrir frutos y
respetuosa del medio ambiente, que según Durango (2009)
mantiene la apariencia fresca, firmeza y brillo, aumentando la
calidad del producto y su valor comercial y se ha demostrado
ser efectivo en la preservación de muchos alimentos,
especialmente en frutas y hortalizas. Los R.B. también pueden
utilizarse como vehículo de aditivos que evitan o reducen el
crecimiento de microorganismos en su superficie, dentro de los
agentes antimicrobianos incorporados a los recubrimientos
vegetales pueden considerarse a los aceites esenciales (Ramos,
et al, 2010). Así mismo los R.B. de quitosano al ser aplicados
en frutos mantiene su calidad más tiempo, por tener carácter
antifúngico o antibacterial y retrasa el deterioro del fruto
(Tanada & Grosso, 2005).
Hernández (2002), El Ghaouth et al. (1992); Meng et al.
(2008) y Sanchez (2008) citado por Ramos, et al. (2010)
afirman que los recubrimientos con quitosano forman una
cubierta en la superficie de los frutos, que actúa como una
Acosptupa- Quispe, et al.: Determinación letal media en nauplios de Artemia salina
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Tabla 1: Formulaciones de recubrimiento biodegradables de quitosano y compuestos bioactivos.
Formulación
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
Aceite esencial (%)
0,25
0
0,5
0
0,5
0
0,6
0,25
0,25
Glicerol (%)
0,3
0
0
0,6
0,6
0,3
0,3
0
0,72
barrera mecánica para proteger al fruto de infecciones causadas
por hongos, ayudando así a disminuir las enfermedades
causadas durante el almacenamiento por Rizophus stolonifer
(Ehrenb:Fr), Botrytis cinerea Pers:Fr, y Alternaria alternata
(Fr.:Fr.) entre otras.
Según Vargas et al. (2006), el recubrimiento de quitosano y
ácido oleico, sobre frutos de fresa reduce la incidencia de
microorganismos hasta en un 80% al término de la evaluación
en comparación con frutos no tratados. Investigaciones de
toxicidad de extractos de plantas en bioensayos sobre Artemia
salina Leach determinan la CL50: según Pereira, E. (2015), el
extracto de hinojo presenta baja toxicidad, alcanzando una
CL50 de 428 ppm, el ají pimienta un valor de 716,1 ppm, el
eneldo 2624,5 ppm y el romero 3172,0 ppm, siendo
considerado los dos últimos no tóxicos, debido a esta
característica, el eneldo tiene una gran aplicabilidad por ser una
hierba aromática y medicinal, presente en muchas regiones de
Brasil, que tiene compuestos beneficioso para el tratamiento y
prevención de enfermedades, siendo consumido sin
restricciones sobre el uso de tés como hierbas.
De acuerdo a Dantas (2016) el extracto de etanol de la
semilla y la cáscara de la semilla del aceite de Moringa presenta
una CL50 de 1783,40 y 1501,71 respectivamente, no
presentando toxicidad. Figueira et al. (2012) evaluó la toxicidad
de plantas brasileñas como la pata de vaca (Bauhinia forficata)
y la albahaca (Ocimun gratissimun) resultando una CL50 de
1780 y 755,5 ppm respectivamente, tal que el extracto de pata-
de-vaca se consideró no tóxico y el extracto de albahaca
presentó una leve toxicidad contra la Artemia salina.
MÉTODOS
Formulación de los R.B.
Se elaboró solución de quitosano de alto peso molecular al
1,00 % p/p disuelto en ácido acético glacial a 1% V/V, a
diferentes concentraciones de aceite esencial de hierba luisa o
limón. Se realizaron nueve formulaciones por cada ensayo
según la Tabla 1.
Organismos de prueba
Fueron los nauplios de Artemia salina Leach, se agregó
18gr de huevos deshidratados de Artemia salina (SERA/
Artemia- mix) en un recipiente de fondo oscuro prevista de un
oxigenador de acuario de 500 ml de agua salina al 30% (NaCl).
Se controló la homogeneidad de huevos para que ellos estén
húmedos e hidratados, desechando los que flotaron, luego se
procedió a colocarlos en una incubadora con luz artificial a
temperatura de 35°C, con aireación constante durante
48h.(Gualdrón & Lopez, 1994).
Evaluación de la toxicidad in vitro
En tubos de 10ml se colocó 5, 10, 25, 50, 100 y 200 µl de
cada una de las formulaciones de R.B. de quitosano al 1 %,
Glicerol y aceite esencial de hierba luisa o de limón. Se realizó
la dilución con agua salina hasta llenar los tubos a 10ml,
agregándose a cada tubo 10 nauplios, los cuales fueron
expuestos a temperatura ambiente por 48 horas y sometidos a
las concentraciones de 500, 1000, 2500, 5000, 10000 y 20000
ppm, para luego tomar lectura del número de nauplios muertos,
cada muestra se realizó por duplicado. Como control se usó
solución salina incorporándose 10 nauplios en ella.
Determinación de la CL50 (concentración letal media)
Con la información del número de nauplios muertos, se
determinó para cada formulación de recubrimientos
biodegradables la concentración letal media CL50 haciendo uso
de la librería ‘drc’ del programa R (Ritz, 2016), de acuerdo a
los valores obtenidos de la CL50 y en base a la Clasificación de
tóxicos según criterios de Williams (1985) (Tabla 2), se
determinó en cada formulación el grado de actividad tóxica.
Comportamiento de la CL50
El comportamiento de las variaciones de la CL50 en los
R.B. de quitosano al 1% a diferentes concentraciones de aceite
esencial de hierba luisa o de limón y glicerol, se determinó con
el paquete estadístico Stafgrafics, usando un análisis de
varianza (ANOVA) y para la determinación de la concentración
óptima se empleó la metodología de superficies de respuesta.
La tabla ANOVA particiona la variabilidad de CL50 del aceite
esencial y del glicerol en piezas separadas para cada uno de los
efectos, entonces prueba la significancia estadística de cada
efecto comparando su cuadrado medio contra un estimado del
error experimental con un nivel de confianza del 95.0%.
Tabla 2: Clasificación de tóxicos CYTED (Programa
iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo)
I
Extremadamente tóxico
II
Altamente tóxico
III
Moderadamente tóxico
IV
Ligeramente tóxico
V
Prácticamente no tóxico
VI
Relativamente inocuo
Fuente: Sanchez, L.(2005)
RESULTADOS
Del porcentaje de mortalidad a las 48 horas de los nauplios
de Artemia salina, reportados en la Tabla 3, se observa que la
mortalidad supera el 50% a partir de 2500 ppm en la mayor parte
de los ensayos con AEHL y en los ensayos con AEL a partir de
1000 ppm.
A partir de la Tabla 3, se determinó los valores de la
concentración letal media, a la que se presenta un 50% de
mortalidad por toxicidad, para cada una de las formulaciones de
R.B. de los ensayos con AEHL y con AEL, lo que se reporta en
la Tabla 4.
Considerando que a mayor CL50 menor es la actividad
tóxica, el orden decreciente en actividad tóxica en los ensayos
con AEHL es como sigue F3, F2, F5, F9, F6, F8, F7, F4 y F1,
de acuerdo a la tabla 2 se afirma que F3 y F2 presenta ligera
toxicidad; F5, F9, F6, F8, F7 y F4 son prácticamente no tóxicos
y F1 es relativamente inocuo. En los ensayos con AEL, el orden
decreciente en actividad tóxica es como sigue F5, F7, F6, F2,
F4, F3, F8, F9 y F1, donde F5, F7, F6, F2, F4, F3 y F8 son
considerados ligeramente tóxicos, F9 prácticamente no tóxico y
F1 es relativamente inocuo.
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Tabla 3: Porcentaje de mortalidad de nauplios de Artemia salina Leach sometidos a diferentes formulaciones de recubrimiento
biodegradables durante 48 horas
Concentración
(ppm)
Mortalidad (%)
control
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
Ensayo
con
AEHL
500
0
40
30
40
30
40
30
20
30
40
1000
0
30
60
70
30
40
40
30
60
40
2500
0
60
70
70
80
80
80
80
40
60
5000
0
70
80
80
60
70
70
80
80
80
10000
0
80
90
70
90
100
80
100
90
90
20000
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Ensayo
con
AEL
500
0
30
40
50
40
40
50
40
30
20
1000
0
20
70
60
70
80
60
80
70
50
2500
0
40
70
50
60
80
70
60
70
60
5000
0
90
80
70
70
80
90
90
70
90
10000
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
20000
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
F1: formulación 1 con 0,25% de aceite esencial y 0,3 % de glicerol. F2: formulación 2 con 0 % de aceite esencial y 0 % de
glicerol. F3: formulación 3 con 0,5 % de aceite esencial y 0% de glicerol. F4: formulación 4 con 0 % de aceite esencial y 0,6 %
de glicerol. F5: formulación 5 con 0,5 % de aceite esencial y 0,6 % de glicerol. F6: formulación 6 con 0 % de aceite esencial y
0,3 % de glicerol. F7: formulación 7 con 0,6 % de aceite esencial y 0,3 % de glicerol. F8: formulación 8 con 0,25% de aceite
esencial y 0% de glicerol. F9: formulación 9 con 0.25% de aceite esencial y 0,72 % de glicerol.AEHL: aceite esencial de hierba
luisa. AEL: aceite esencial de limón.
Tabla 4: Concentración letal media (CL50) de formulaciones de recubrimientos biodegradables con quitosano al 1% en
nauplios de Artemia salina Leach en 48 horas.
Formulación
Ensayo
AEHL CL50
(ppm)
Límite de confianza
95%
Ensayo
AEL
CL50
(ppm)
Límite de confianza
95%
AE %
p/p
G%
p/p
Inferior
Superior
Inferior
Superior
F1
0.25
0.3
1550
390
2700
2180
390
3960
F2
0
0
930
540
1320
640
160
1130
F3
0.5
0
580
0
1460
730
0
1920
F4
0
0.6
1470
160
2780
700
0
1610
F5
0.5
0.6
1010
220
1800
540
70
1010
F6
0
0.3
1230
380
2080
590
230
950
F7
0.6
0.3
1410
900
1910
570
0
1310
F8
0.25
0
1270
0
2750
820
30
1600
F9
0.25
0..72
1190
550
1830
1260
710
1810
La presencia de una relación entre la cantidad usada de
aceite esencial y glicerol en los R.B. de quitosano al 1 % se
obtiene de los resultados del ANOVA, que particiona la
variabilidad separadamente para cada uno de los efectos del
aceite esencial usado y del glicerol sobre la CL50, cuya gráfica
de efectos principales muestra la figura 1 y cuyos coeficientes
de regresión múltiple para ambos ensayos se presentan en la
tabla 5, del cual resulta las relaciones:
CL50= 906,338 + 1171,29*AEHL + 2938,88*G - 2604,1*
AEHL^2 - 360,333*AEHL*G - 3693,1*Glicerol^2 (1)
CL50 = 795,145 + 1187,81*AEL + 4298,03*G –
828,167*AEL*G (2)
Se recomienda hacer estudios de la formulación obtenida
por la optimización de la ecuación 1 con 0.198 % p/p de AEHL
y 0.388 % p/p de G que permita incrementar el valor de CL50
a 1592,79 ppm.
Ambas ecuaciones muestran sobre la CL50 un efecto positivo
del aceite esencial de hierba luisa o limón y del glicerol al
actuar independientemente, la que se ve disminuida por el
efecto conjunto de ambos factores. Sin embargo, frente a la
necesidad de elaborar R.B. de quitosano donde el glicerol le da
elasticidad a los recubrimientos y el aceite esencial aumente el
efecto fungicida se optimiza el modelo de la ecuación 1 y 2
mediante la metodología de superficie de respuestas, cuyos
resultados de la combinación de los niveles de factores se
muestra en la tabla 6, del cual resulta un valor de CL50máximo
e igual a 1592,79 ppm con 0.198 % p/p de AEHL y 0.388 %
p/p de G, y en los ensayos con AEL resulta un valor de CL50
máximo e igual a 1104,6 ppm con 0 % p/p de AEL y 0.72%
p/p de G.
Acosptupa- Quispe, et al.: Determinación letal media en nauplios de Artemia salina
39
(a) (b)
Figura 1: Efectos principales de la CL50 ante variaciones de aceite esencial y glicerol en las formulaciones de recubrimiento
biodegradables con quitosano al 1%: (a) Ensayos con AEHL, ( b )Ensayos con AEL
Tabla 5: Coeficientes de regresión de la relación de concentración letal media (CL50) de recubrimientos biodegradables con
quitosano al 1% con incorporación de AE y G
Coeficiente
Estimado AEHL
Valor p
Estimado AEL
Valor p
constante
0.906338
0.795145
A:AE
1.17129
0.0037
0.118781
0.0130
B: G
2.93888
0.0075
0.429803
0.0192
AA
-2.6041
0.4482
-0.828167
0.0154
AB
-0.360333
0.0089
0
BB
-3.6931
0.1736
0
Tabla 6: Maximización de la concentración letal media (CL50) de recubrimientos biodegradables con quitosano al 1% con
la proporción de AE y G
Ensayo con AEHL
Ensayo con AEL
Factor
Bajo
Alto
Óptimo
Factor
Bajo
Alto
Óptimo
AE
0.0
0.6
0.198007
AE
0.0
0.6
2.13837E-8
G
0.0
0.72
0.388282
G
0.0
0.72
0.72
Optimizar Respuesta
Meta: maximizar CL50 con AEHL
Valor óptimo = 1592,79
Optimizar Respuesta
Meta: maximizar CL50 con AEL
Valor óptimo = 1104,6
DISCUSIÓN
Dantas, D. (2016) en su estudio con Nauplios de Artemia
salina Leach obtuvo una CL50 de 1501,71 ppm para la cáscara
de semilla del aceite de Moringa afirmando que esta es no
toxica por resultar la CL50 > 1000 ppm, el valor de la CL50
obtenida por Dantas es inferior al determinado en este estudio
con la formulación 1 de 0,25% de AEHL - 0,3% de G y CL50
de 1550 ppm e inferior a la obtenida con 0,25% de AEL y 0,3%
de G y CL50 de 2180 ppm ambas catalogadas como
relativamente inocuas según la clasificación de tóxicos
CYTED. Las formulaciones F5, F9, F6, F8, F7 y F4 sen los
ensayos con AEHL son consideradas prácticamente no tóxicas
según la misma clasificación.
Pereira, E. (2015) en su trabajo de toxicidad con Nauplios
de Artemia salina Leach determinó para el hinojo una CL50 de
428 ppm, afirmando que este presenta baja toxicidad y para el
ají pimienta una CL50 de 716,1 ppm, afirmando que este
presenta moderada toxicidad. Valores cercanos a estos
obtuvimos con la formulación 3 con CL50 de 580 ppm y con la
formulación 2 con CL50 de 930 ppm en ensayos con aceite
esencial de hierba luisa, ambas ligeramente tóxica de acuerdo a
la clasificación de tóxicos CYTED
De las formulaciones no tóxicas realizadas para el ensayo
con aceite esencial de limón, se obtuvo mejor resultado en la
formulación 1 con 0,25% de AE y 0,3% de G presenta una CL50
de 2180 ppm inferior a la obtenida por Pereira, E. (2015) con el
extracto de eneldo con valor de CL50 de 2624,5 ppm, pero
superior a la obtenida por Figueira et al. (2012) con el extracto
de pata de vaca con CL50 de 1780 ppm y a la obtenida por
Dantas, D. (2016) con el extracto de semilla del aceite de
Moringa con una CL50 de 1783,40. La formulación 9 con 0,25%
de AE y 0,72% de G presenta una CL50 de 1260 ppm inferior a
la obtenida por Dantas, D. (2016) con la cáscara de la semilla
del aceite de Moringa con CL50 de 1501,71 ppm. Las
formulaciones que presentan ligera toxicidad, con valores de
CL50 de 730, 700 y 820 ppm en las formulaciones 3, 4 y 8
respectivamente, presentan valores cercanos al ají pimienta con
CL50 de 716,1 ppm obtenida por Pereira, E. (2015), las
formulaciones 2, 5, 6 y 7 con CL50 de 640, 540, 590 y 570 ppm
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presentan valores superiores a la obtenida para el hinojo con
CL50 de 428 ppm estudiado por Pereira, E. (2015).
CONCLUSIONES
1. En la evaluación de la actividad tóxica de las formulaciones
desarrolladas de recubrimientos biodegradables con aceites
esencial de hierba luisa y de limón, se obtuvo como
resultado que estas están comprendidas entre ligeramente
tóxica, prácticamente no toxica y relativamente inocuo.
2. Se determinó que las formulaciones desarrolladas de
recubrimientos biodegradables con aceite esencial de hierba
luisa presenta menor actividad tóxica frente a las
desarrolladas con aceite esencial de limón (AEL).
3. Las formulaciones de recubrimientos biodegradables que
no tienen actividad tóxica para ser usados como
recubrimientos en frutos de fresa y poder extender su
tiempo de vida postcosecha es la formulación 1 con 0,25%
de aceite esencial de hierba luisa y 0,3% de glicerol con una
CL50 de 1550 ppm.
AGRADECIMIENTOS:
Los autores expresamos nuestros agradecimientos:
- Al Vicerrectorado de Investigación de la Universidad
Nacional San Antonio Abad del Cusco por haber hecho
posible la realización de este trabajo de investigación con
Fondos Canon.
- A los Departamentos Académicos de Física, Biología y
Química por la facilidad del uso de sus laboratorios.
- Al director y responsables del laboratorio de Control de
Calidad, por la facilidad del uso de sus instalaciones.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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Presentado: 10.10.2021
Aceptado: 14.11.2021
Publicado: 31/01/2022