Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco
13
Dra. Espinoza Carrasco Heldy
(1)
, Dra. Flores Calderón Dariela
(1)
, Dr. Cazorla Cornejo Ernesto
(1)
, Dra.
Garcia Cancino Apolinaria Del Rosario
(2)
Blga. Sanchez Huamán Catherine
(1)
, Br. Latorre Farfan Libio
(1)
heldyiyi@hotmail.com
(1)
Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco
(2)
Universidad de Concepción Chile.
RESUMEN
Helicobacter pylori es una bacteria que
coloniza la supercie de la mucosa gástrica,
induciendo, en la mayoría de las personas una
inamación crónica asintomática. Es considerado
el más frecuente agente etiológico de la úlcera
gastroduodenal y como un factor de riesgo para
el desarrollo a largo plazo de cáncer gástrico.
Estudios epidemiológicos han mostrado que la
colonización por Helicobacter pylori ocurre en
forma más temprana, frecuente e intensa en
individuos que viven en países en desarrollo
que en aquellos de países industrializados
que tienen mejores condiciones de higiene.
El cáncer gástrico es un importante problema
de salud que se relaciona con alta morbilidad
y mortalidad, representa la segunda causa de
muerte relacionada con cáncer.
El objetivo del estudio fue determinar si
las cepas de Lactobacillus spp. son capaces de
inhibir el crecimiento de cepas de Helicobacter
pylori procedentes de biopsias gástricas
de pacientes. La metodología utilizada
fue aislamiento, cultivo e identicación de
Helicobacter pylori, Lactobacillus spp y la
inhibición del crecimiento de helicobacter pylori
mediada por cepas de lactobacillus spp., se
muestreó un total de 200 pacientes de los cuales
135 fueron HP+ (Helicobacter pylori positivos).
No se encontró diferencias signicativas entre
factores como la edad, sexo y procedencia
geográca con la infección por esta bacteria. Se
logró aislar un total de 47 cepas de Lactobacillus
spp de un total de 200 pacientes de los cuales 31
cepas pertenecían a pacientes que presentaban
también a Helicobacter pylori. Sin embargo no
se encontró relación a nivel estadístico por la
prueba del Chi-cuadrado entre ambos grupos.
Lactobacillus spp. mostró acción
inhibitoria frente a Helicobacter pilori en un
89.4% y el espectro de inhibición microbiana
producida por Lactobacillus spp. osciló entre 1.0
y 2.5 cm.
PALABRAS CLAVES : Helicobacter pylori, Lactobacillus spp, microaerofílico
DETECCIÓN Y CARACTERIZACION PARCIAL DE BACTERIOCINAS
PRODUCIDAS POR LACTOBACILLUS SPP CON
ACCION ANTI HELICOBACTER PYLORI
Revista de Ciencias Biologicas CANTUA
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ABSTRACT
Helicobacter pylori is a bacterium that
colonizes the gastric mucosa surface, leading
in most individuals an asymptomatic chronic
inammation. It is considered the most
common etiologic of gastroduodenal ulcer and
a risk factor for gastric cancer. Epidemiological
studies have shown that Helicobacter pylori
colonization occurs early and frequently in
individuals who live in developing countries
than in those who lives in industrialized
countries. Gastric cancer is a great health
problem that is associated with high morbidity
and mortality. It represents the second cause
of death related to cancer. The objective of the
present study was to determine if the strains of
Lactobacillus spp. are able to inhibit the growth of
Helicobacter pylori strains from patients gastric
biopsy. The methodology used is the isolation,
culture and identication of Helicobacter
pylori, Lactobacillus spp and growth inhibition
of Helicobacter pylori mediated to Lactobacillus
spp., were studied 200 patients, 135 were HP
+ (Helicobacter pylori positive). No signicant
dierences between factors such as age, sex
and geographical origin with infection by this
bacterium was found. Have been isolated 47 of
200 patients strains of Lactobacillus spp which
31 strains belonged to patients who also had
Helicobacter pylori. However no relationship
was found statistically by the Chi - square test
between groups.
Lactobacillus spp. jhowed inhibitory activity against Helicobacter pylori in 89.4 % and microbial inhibition
spectrum produced by Lactobacillus spp. ranged from 1.0 to 2.5 cm.
INTRODUCCION
Helicobacter pylori es una bacteria que
coloniza la supercie de la mucosa gástrica,
induciendo en la mayoría de las personas
una inamación crónica y asintomática. Es
considerado el más frecuente agente etiológico
de la úlcera gastroduodenal y como un factor
de riesgo para el desarrollo a largo plazo de
cáncer gástrico. Estudios epidemiológicos han
mostrado que la colonización por Helicobacter
pylori ocurre en forma más temprana,
frecuente e intensa en individuos que viven
en países en desarrollo que en aquellos de
países industrializados que tienen mejores
condiciones de higiene. (Obregón C., y cols.
2003). Helicobacter pylori es un patógeno
humano con amplia distribución mundial, las
tasas de prevalencia encontrados en los países
en vías de desarrollo son más altas que en
los países desarrollados de allí, que entre las
estrategias de control y erradicación de esta
bacteria esta el conocimiento de la prevalencia
de la infección por este microorganismo y la
difusión de medidas preventivas en base a la
explicación de los principios y de la causalidad
de dicha infección. Se ha demostrado que cepas
probióticas de Lactobacillus pueden residir
temporalmente en el estómago y adherirse a
la mucosa gástrica, posiblemente interriendo
con el desarrollo de Helicobacter pylori. Los
probióticos pueden modular la colonización
de la mucosa gástrica .Esta actividad puede
ser realizada por las bacterias acido lácticas
mediante la producción de acido láctico,
peroxido de hidrogeno y bacteriocinas, estas
últimas capaces de afectar la integridad de la
membrana por formación de poros. (Contreras
F., y cols 2007). Dada la importancia que en
la actualidad están tomando los probióticos
como alimentos funcionales y en particular las
bacteriocinas que producen, resulta interesante
conocer algunas características de estas
sustancias y sus propiedades antimicrobianas.
Es por esta razón que el presente trabajo de
investigación tiene por objetivo evaluar si las
cepas de Lactobacillus spp. son capaces de
inhibir el crecimiento de cepas de Helicobacter
pylori aisladas de biopsias gástricas de pacientes
que acuden al Hospital Regional del Cusco. De
allí que el objetivo de esta investigación es
determinar si las cepas de Lactobacillus spp.
son capaces de inhibir el crecimiento de cepas
de Helicobacter pylori procedentes de biopsias
gástricas de pacientes, y estudiar el espectro
de inhibición microbiana de Lactobacillus
spp frente a las cepas de Helicobacter pylori
de esta investigación se desarrolla de acuerdo
a la metodología planteada por el CLAHP
(Centro Latinoamericano de Investigación de
Helicobacter pylori).
Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco
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AISLAMIENTO, CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE
Helicobacter pylori
1. Se requirieron cuatro muestras de biopsia
gástrica por paciente (2 de antro y 2 de
cuerpo) tomadas por el personal responsable
del servicio de Endoscopia Digestiva.
2. Una biopsia de antro y otra de cuerpo fue
sometida a la prueba de la ureasa rápida en
el mismo consultorio de Gastroenterología.
3. Para el cultivo, las muestras se transportaron
inmediatamente al laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Ciencias
Biológicas a temperatura ambiente en un
tubo vacuteiner con 0.5 ml de solución
siológica estéril.
4. En el laboratorio estas muestras se trituraron
para lo cual se utilizó un tubo de ensayo de
menor diámetro al tubo bacuteiner que se
usó como pistilo.
5. Se sembró en Agar Columbia suplementado
con sangre de cordero al 5 % más un
suplemento selectivo DENT que contiene
antibióticos y antifúngicos que impiden el
crecimiento de bacterias contaminantes y
de algunos hongos (vancomicina 10 mgr/
ml, trimetoprim 5 mgr/ml y polimixina B 0,25
mgr/ml).
6. Las placas se incubaron a una temperatura
de 37ºC por un tiempo de 3 -10 días, en jarra
de anaerobiosis en un ambiente húmedo y
microaerolo.
7. Al cabo de 3 - 10 días se procedió a
la identicación de Helicobacter pylori.
Para identicar las cepas se utilizaron
las siguientes pruebas de diferenciación
bioquímica: Ureasa, Catalasa, Oxidasa.
8. Se realizó la tinción GRAM para la visualización
microscópica.
AISLAMIENTO, CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE
Lactobacillus spp.
1. Para el aislamiento de Lactobacillus spp se
inocularon 0,1 ml del homogeneizado de la
biopsia gástrica en 1 ml de caldo MRS (Oxoid)
2. Se incubaron a 37°C en atmósfera con 10%
de CO
2
durante 2 días.
3. Los caldos que resultaron con crecimiento
positivo fueron sembrados en placas de
agar MRS e incubados en las condiciones ya
descritas.
4. A las colonias sospechosas de Lactobacillus
spp se les realizó tinción de Gram, prueba de
catalasa y oxidasa. (Los pacientes colonizados
por Lactobacillus spp fueron aquéllos que
presentaron cultivo en agar MRS positivo.)
5. Para realizar los ensayos de propiedades
probióticas, las cepas de Lactobacillus spp
se reactivaron mediante 2 subcultivos
consecutivos de 1 día cada uno, en caldo
MRS a 37°C.
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE Helicobacter
pylori MEDIADA POR CEPAS DE Lactobacillus spp.
1. Para realizar este proceso se requería de cultivos
recientes de Helicobacter pylori de no más de
tres días y con un cultivo abundante, en aquellos
cultivos donde se observó un crecimiento escaso
se procedió a multiplicar las cepas reincubando
por 2 días mas en las condiciones anteriormente
señaladas para el aislamiento.
2. Al obtener un cultivo regular o abundante, se
procedió a realizar antibiograma, para esto
se recogió con un hisopo estéril las colonias
presentes en la placa (si el cultivo era puro)
o con una asa de siembra (si el cultivo estaba
contaminado).
3. Luego se realizó una emulsión en 0.5ml de
solución salina siológica, hasta llegar a una
densidad equivalente al MF Nº2. (10
4
ufc/ml)
4. Por otro lado en placas de agar Müeller-Hinton,
suplementadas con 5% de sangre de caballo
desbrinada, se realizaron oricios de 5 mm de
diámetro.
5. Antes de que transcurran 15 minutos de haber
ajustado el inóculo, se introdujo un hisopo estéril
dentro de la suspensión y se inoculó a las placas
de Mueller-Hinton completamente, sin dejar
ninguna zona libre.
6. Posteriormente en los oricios se inocularon
0,03 ml de Lactobacillus spp reactivados como se
describió anteriormente.
7. Finalmente, se midieron los halos de inhibición
a los 4 días de incubación, los que fueron
comparados con los halos producidos por las
cepas de referencia utilizadas.
Revista de Ciencias Biologicas CANTUA
16
Estadística. Los resultados se recolectaron en
tablas de contingencia y fueron analizados según
test de Chi cuadrado y correlaciones, con intervalos
de conanza de 95%.
RESULTADOS
Aislamiento de Helicobacter pylori.
Se muestreó a un total de 200 pacientes de los cuales
135 fueron HP+ (Helicobacter pylori positivos),
como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1: Porcentaje de infección por Helicobacter
pylori.
Nº de pacientes %
Pacientes HP+ 135 67
Pacientes HP- 65 33
Total 200 100
Fuente: Ficha de investigación
Estudio de la presencia de Helicobacter
pylori según grupo etareo.
La distribución por edades en los pacientes
HP+ se muestra en la Figura 1. Se observa
porcentajes más altos de positividad entre los
31 y 50 años. Los enfermos más jóvenes (entre
11 y 20 años) y los más ancianos (más de 71
años) presentan porcentajes menores de HP+.
Figura 1: Pacientes infectados con Helicobacter
pylori según grupo etareo.
Aislamiento de Lactobacillus spp.
Se muestreo a un total de 200 pacientes de los
cuales en 47 pacientes se logro aislar cepas de
Lactobacillus spp, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2: Porcentaje de infección por Helicobacter
pylori.
Nº de pacientes %
Pacientes
Lactobacillus+
47 23
Pacientes
Lactobacillus -
153 77
200 100
Fuente: Elaboración propia según resultados
muestreados
Según los resultados del 100% de pacientes de
los que se logró aislar Lactobacillus spp., el 66%
de cepas aisladas de Lactobacillus pertenecían
a pacientes que eran HP +, y el 34% restante
pertenecían a pacientes que no presentaban
infección por Helicobacter pylori.
Tabla 3: Porcentaje de aislamiento de Lactobacillus
spp. en pacientes Hp+ por Helicobacter pylori.
7
12
21
23
13
17
4
2
0
5
10
15
20
25
Porcentaje
11--20
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70
71-80
81- +
Grupo etareo
Fuente: Elaboración propia según resultados de laboratorio
Nº de
pacientes
Lactobacillus
spp. +
%
Pacientes Hp + 135 31 66
Pacientes Hp - 65 16 34
Total 200 47 100
Fuente: Elaboración propia según resultados de muestreo
Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco
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Figura 2. Porcentaje de cepas de H. pylori que
muestran inhibición frente a Lactobacillus casei.
36%
8%
33%
26%
64%
92%
67%
74%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 TOTAL
Menor Inhibicion Mayor Inhibicion
Fuente: Elaboración propia según resultados de
laboratorio
En la gura 2 se observa que en el primer
ensayo de 14 cepas de H. pylori que presentaron
inhibición frente a Lactobacillus casei, 9 presen-
taron una mayor inhibición y 5 una menor inhi-
bición, en el segundo ensayo de 13 cepas de H.
pylori, 12 presentaron una mayor inhibición y 1
presentó una menor inhibición, en el tercer en-
sayo de 9 cepas de H. pylori, 6 presentaron una
mayor inhibición y 3 una menor inhibición. La
interpretación de los datos antes mencionados
se da en base a la comparación a los halos de
inhibición obtenidas en la Prueba Piloto reali-
zada frente a la Cepa patrón ATCC 43504.
RESULTADOS
1. Se logró aislar un total de 135 cepas de
Helicobacter pylori de un total de 200 pacientes.
No se encontró diferencias signicativas entre
factores como edad, sexo y procedencia
geográca con la infección por esta bacteria.
2. Se logró aislar un total de 47 cepas de
Lactobacillus spp, de un total de 200 pacientes
de los cuales 31 cepas pertenecían a pacientes
que presentaban también Helicobacter pylori.
3. Lactobacillus spp. mostró acción inhibitoria
frente a Helicobactr pylori en un 89.4%.
4. El espectro de inhibición microbiano
producidas por Lactobacillus spp. osciló entre
1.0 y 2.5 cm.
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