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Marcadores moleculares RFLP rRNA 23s para la identificación de especies del género
Bacillus
Molecular markers RFLP rRNA 23s for the identification of species of the genus Bacillus
María Antonieta Quispe–Ricalde1*, Paola Elorrieta–Mamani1, José Luis Sierra–Herrera2
1 Departamento de Biología, Escuela Profesional de Biología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de San
Antonio Abad del Cusco, Av. La Cultura, 733, Cusco, Perú
2 Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
*Autor corresponsal: María Antonieta Quispe–Ricalde, antonieta.quispe@unsaac.edu.pe
RESUMEN
El género Bacillus es taxonómico y filogenéticamente complejo, y para definir la pertenencia a este género se necesita la secuencia
del gen rRNA 16S y la capacidad de formar esporas en condiciones aeróbicas; sin embargo, estos datos no son suficientes por lo
que se han descrito varios marcadores genéticos los que actualmente son utilizados. En el presente trabajo se realiza una búsqueda
de sitios de restricción en secuencias del gen rRNA 23S de 31 cepas de distintas especies del género y que han sido obtenidas del
banco de datos de libre acceso, lo cual ha permitido definir patrones de corte de cada enzima, patrones que se aplicaron a los datos
experimentales de amplificación el gen rRNA 23S seguido de RFLP de 8 cepas del género Bacillus. Con la metodología planteada
se puede hacer una aproximación a la separación en grupos de especies dentro del género Bacillus. La identificación de marcadores
moleculares incrementa los datos necesarios para continuar con la formación de subgrupos dentro del género, o la definición de la
pertenencia al género Bacillus.
Palabras clave: Bacillus, rRNA 23S, RFLP.
ABSTRACT
The genus Bacillus is taxonomically and phylogenetically complex, and to define membership in this genus the 16S rRNA gene
sequence and the ability to form spores under aerobic conditions are needed; However, these data are not sufficient, which is why
several genetic markers have been described and are currently used. In the present work, a search for restriction sites is carried out
in sequences of the 23S rRNA gene of 31 strains of different species of the genus and that have been obtained from the free access
data bank, which has made it possible to define cutting patterns of each enzyme. patterns that were applied to the experimental data
of amplification of the 23S rRNA gene followed by RFLP of 8 strains of the genus Bacillus. With the proposed methodology, an
approach can be made to the separation into groups of species within the genus Bacillus. The identification of molecular markers
increases the data necessary to continue with the formation of subgroups within the genus, or the definition of membership in the
genus Bacillus.
Key words: coliforms, Bacillus, rRNA 23S, RFLP.
INTRODUCCIÓN
El género Bacillus comprende bacterias aeróbicas y
anaeróbicas formadoras de esporas, son de forma bacilar, cuya
especie tipo es Bacillus subtilis (Harwood, 1992). Este género
alberga especies de importancia para el hombre desde el punto
de vista de la salud, como también desde el punto de vista de su
utilidad en biotecnología. Las especies más importante son
Bacillus anthracis, agente causal del ántrax, y Bacillus cereus
responsable de muchas intoxicaciones alimentarias. En
biotecnología es importante Bacillus thuringiensis utilizado en
pesticidas para la agricultura y Bacillus subtilis que es
productora de enzimas de uso industrial.
Taxonómica y filogenéticamente el género Bacillus es un
grupo heterogéneo en el que se han descrito hasta 51 especies
definidas en base a la secuencia del gen rRNA 16S (Ash, 1991)
y a la capacidad de formar de esporas en condiciones aeróbicas.
Las especies del género han sido separados en 5 grupos o
clusters para unos autores mientras que otros proponen la
existencia de 6 grupos (Lui, 2013), esto indica que debe de
haber una reclasificación de muchas especies que están dentro
del género, y para poder realizar esta reclasificación es
necesario definir patrones genotípicos y fenotípicos.
La publicación de datos genéticos y su libre disponibilidad,
permiten su uso en estudios que conduzcan a encontrar
características genéticas, que contribuyan a restringir su uso
para la definición de una especie del género Bacillus, entre ellos
están los marcadores moleculares de determinadas partes del
genoma. El gen rRNA 23S se ha utilizado de forma limitada
para identificar a especies bacterianas y no hay datos de su uso
en la filogenia del género Bacillus. Por esta razón en el presente
estudio se realizaron análisis comparativos de secuencias del
gen rRNA 23S, y dentro de esta secuencia se realiza la búsqueda
de marcadores moleculares de utilidad, se trata de ubicar sitios
de restricción conservados como marcadores y así poder
diferenciar a las distintas especies del género Bacillus. El gen
rRNA 23S puede otorgar datos que contribuyan a su
clasificación a diferentes niveles filogenéticos. Para comprobar
la utilidad de algunos marcadores moleculares identificados en
el gen rRNA 23S, estos han sido aplicados de forma práctica a
aislamientos de cepas a partir de muestras ambientales.
METODOLOGÍA
Cepas bacterianas. Ocho cepas del género Bacillus se
seleccionaron del banco de cepas del laboratorio de genética y
biotecnología microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas
de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
Estas cepas fueron aisladas a partir de aguas de procesamiento
de la industria de curtiembre artesanal ubicada en el distrito de
Sicuani (Canchis, Cusco), para el proceso de cultivo y
mantenimiento en el laboratorio, se siguió lo indicado por
Ramírez y Benítez 2013. Las cepas que se analizaron tienen los
siguientes códigos: Cr-8, Cr-11, Cr-14, Cr-18, Cr-20, Cr-23, Cr-
24, Cr-30.
Extracción y cuantificación de ADN. El ADN fue extraído a
partir de 5 ml de cultivo con el kit Wizard® Genomic DNA
purification kit (Promega Biotech), se siguieron las
CANTUA Vol. 19 (1): 23-31 (2019). Versión Online ISSSN 2709-8817
Quispe–Ricalde, et al.: marcadores moleculares, Bacillus
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indicaciones del fabricante en todo el procedimiento. Se
cuantificó el ADN extraído por espectrofotometría (Denovix),
donde se utiliza 2 ul de cada muestra, de igual forma para
observar la integridad del ADN extraído, se realizó
electroforesis en geles de agarosa al 0.8% en tampón TAE (Tris
0.1M, ácido acético, EDTA M).
Amplificación del gen rRNA 23S. La amplificación del gen
rRNA 23S se realizó con los cebadores 1023V
(5´GCGTAAYAGCTCACT3´) y 504R
(5´SWGTTCGRVAWGGGA3´), de acuerdo a la metodología
descrita por Arahal et al., 2002; se preparó la mezcla de
reacción de PCR con concentraciones finales de tampón de la
enzima a 1X, MgCL2 2.5 mM, dNTPs 200 µM, cada cebador
10 ρmol, taq polimerasa 0.5 U y ADN 5 ŋg. A 23 µl de la mezcla
de reacción de PCR se agregó 2µl de ADN correspondiente a
cada cepa. Se utilizó agua como control de la reacción de PCR.
Los ciclos de amplificación son 45 segundos de
desnaturalización a 94˚C, seguido de 45 segundos a 56˚C que
es la temperatura de hibridación de los cebadores y 1 minuto
para el paso de elongación a 72˚C, con una desnaturalización
inicial a 94˚C por 4 minutos y una elongación final a 72˚C por
7 minutos.
Reacciones de digestión con enzimas de restricción. El
polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP), fue realizado utilizando las enzimas Hind III, Sac I,
Hae III y Rsa I, utilizando las condiciones recomendadas por
los fabricantes. Para cada reacción se utilizó 170 ŋg totales del
producto de PCR, tampón 1X y de enzima se utilizó 1U en cada
reacción, en un volumen final de 17 µl. Las reacciones se
incubaron a 37°C en baño maría durante 12 horas.
Electroforesis en geles de agarosa y determinación de los
tamaños de los productos de digestión. Para la visualización
de la amplificación del fragmento del gen rRNA 23s se utilizó
1% de agarosa en tampón TAE 1X, a 90 voltios constantes por
1 hora. Los fragmentos producidos por las enzimas de
restricción fueron separados en geles de agarosa al 1.5%, a 90
voltios constantes por 1.5 horas. La digitalización de las
imágenes de los geles se realizó en el fotodocumentador
GelDoc (Biorad) y el análisis de los fragmentos amplificados y
el cálculo del tamaño de los fragmentos de digestión por las
enzimas de restricción fue realizado en el software Imagen
(BioRad).
Secuencias del gen rRNA 23S.- Las secuencias del gen rRNA
23s utilizadas en este trabajo corresponden a secuencias del
banco de genes publicadas en la base de datos del NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/), se utilizaron
secuencias del gen completo rRNA 23S.
Análisis de restricción teórico. para el análisis se utilizó el
programa MEGA 7.0 (Felsenstein, 1985; Tamura et al., 2007),
primero se realiza el alineamiento de las secuencias rRNA 23S
descargadas del banco de genes, se ubica la posición del
cebador sentido y anti-sentido con el objetivo de restringir al
fragmento de amplificación del gen rRNA 23S. En las
secuencias se ubica los sitios de restricción que corresponden a
las enzimas HindIII (A/AGCTT), SacI (GAGCT/C), HaeIII
(GG/CC), RsaI (GT/AC) y se calcula los tamaños de los
fragmentos que producen. Se construyen una tabla de cortes y
en base a esta información se construye los mapas de restricción
teóricos de las secuencias de las diferentes especies del género
Bacillus. Todas las posiciones que contienen intervalos o
posiciones en blanco fueron eliminadas.
RESULTADOS
Utilizando los cebadores 1023V y 504R se amplificó un
fragmento de 1927 pb (Fig. 1), el cual se somete a la digestión
con las enzimas de restricción. Los cortes producidos fueron
resueltos en geles de agarosa y se determinó el tamaño de los
mismos, cuando los cortes de cada cepa fueron de tamaño muy
cercano, que indica que puede tratarse el mismo tamaño de
fragmento, se realiza un promedio y calcula la desviación
estándar, con este procedimiento obtenemos los patrones de
corte consenso. Cabe indicar que en los geles de agarosa no se
pueden ver los fragmentos menores a 50 pb, por lo que estos
fragmentos no son considerados en el análisis, así mismo en la
medición del tamaño del fragmento se considera un rango de
error de 50 pb, producto del límite de resolución que puede
discriminar un gel de agarosa al 1.5% (Quispe, 2003).
Figura 1. Producto de amplificación del gen rRNA 23S. 1:
marcador de tamaño molecular, 2 y 3: producto de 1027 pb del
gen rRNA 23S.
RFLP con la enzima de restricción SACI. La enzima de
restricción SacI no realiza cortes en el fragmento de
amplificación, por lo que el fragmento de amplificación del gen
ARNr 23S permanece intacto. Los resultados de la digestión
con esta enzima se muestran en la figura 2.
RFLP con la enzima de restricción HindIII. La enzima no
tiene las secuencias palindrómicas en el fragmento amplificado
del gen rRNA 23S, y no genera ningún corte todas las cepas en
estudio (Fig. 3).
RFLP con la enzima de restricción HaeIII. La enzima realiza
4 cortes en el fragmento amplificado del gen rRNA 23S,
generando 5 fragmentos en todas las cepas en estudio (Fig. 4).
En base a estos se construye un patrón de corte consenso para
las 8 cepas analizadas y que está representado por 586.84pb,
504.96 pb, 403.44pb, 268.62 pb, 160.22 pb (Tabla 1).
CANTUA Vol. 19 (1): 23-31 (2020). Versión Online ISSSN 2709-8817
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Figura 2. RFLP con la enzima de restricción SacI. 1: Marcador de tamaño molecular de 100pb; 2: cepa Cr-8; 3: cepa Cr-11; 4:
cepa Cr-14; 5: cepa Cr-18; 6: cepa Cr-20; 7: cepa Cr-23; 8: cepa Cr-24; 9: cepa Cr-30.
Figura 3. RFLP con la enzima de restricción HindIII. 1: cepa Cr-8; 2: cepa Cr-11; 3: cepa Cr-14; 4: cepa Cr-18; 5: cepa Cr-20;
6: cepa Cr-23; 7: cepa Cr-24; 8: cepa Cr-30; 9: Marcador de tamaño molecular de 100pb.
Figura 4. Resultados de RFLP con la enzima HaeIII. 1: cepa Cr-8; 2: cepa Cr-11; 3: cepa Cr-14; 4: cepa Cr-18; 5: cepa Cr-20;
6: cepa Cr-23; 7: cepa Cr-24; 8: cepa Cr-30; 9: Marcador de tamaño molecular de 100pb.
Quispe–Ricalde, et al.: marcadores moleculares, Bacillus
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Tabla 1. Fragmentos de restricción generados con la enzima HaeIII. Se muestran los tamaños en pares de bases (pb) de los
fragmentos visibles en el gel de agarosa al 1.5%.
Tabla 2. Fragmentos de restricción generados con la enzima RsaI. Se muestran los tamaños en pares de bases (pb) de los
fragmentos visibles en el gel de agarosa al 1.5%.
Figura 5: Resultados de RFLP con la enzima de restricción RsaI. 1: cepa Cr-8; 2: cepa Cr-11; 3: cepa Cr-14; 4: cepa Cr-18; 5:
cepa Cr-20; 6: cepa Cr-23; 7: cepa Cr-24; 8: cepa Cr-30; 9: Marcador de tamaño molecular de 100pb.
RFLP con la enzima de restricción RsaI. La enzima realiza 5
cortes produciendo 6 fragmentos cuyos tamaños van desde 137
pb hasta 473 pb (Fig. 5), en la tabla 2 se encuentran el cálculo
de los tamaños de los fragmentos. Esta enzima otorga un patrón
de corte más complejo y como se puede ver en la figura 5, las
cepas en estudio poseen el mismo patrón de corte, por tanto, no
existe polimorfismo en este punto de restricción para las cepas
estudiadas.
Se han utilizado 4 enzimas de restricción para cortar el
fragmento del gen rRNA 23s, y en todos los casos los patrones
de corte de las enzimas es el mismo para las 8 cepas analizadas,
por lo que es posible que se traten de la misma especie. Estas
cepas pertenecen al género Bacillus, identidad que fue
determinada por homología de la secuencia del gen rRNA 16S,
información corresponde al banco de cepas del laboratorio de
Genética y Biotecnología Microbiana.
Análisis teóricos de los perfiles de restricción de especies del
género Bacillus. La tabla 3 contiene la relación de secuencias
del gen rRNA 23S de cepas utilizadas en este estudio, todas
ellas pertenecen al banco de genes del NCBI. Cabe indicar que
la búsqueda incluye secuencias completas del gen rRNA 23S.
Como se indicó antes el producto de amplificación del
fragmento del gen rRNA 23S de las cepas Cr-8, Cr-11, Cr-14,
Cr-18, Cr-20, Cr-23, Cr-24 y Cr-30 tienen un mismo patrón
para las enzimas HindIII, HaeIII y RsaI, por lo que en las figuras
6, 7 y 8 se agrupan todas ellas con el código CR y de esta forma
facilitar el análisis comparativo.
N°
muestra
Tamaño molecular de los amplicones en pb
1
Cr-8
578.18
500.00
396.54
262.46
2
Cr-11
578.18
500.00
396.54
265.55
3
Cr-14
595.56
503.59
407.95
262.96
4
Cr-18
578.18
503.59
402.63
265.55
5
Cr-20
591.15
507.20
405.28
268.18
6
Cr-23
586.79
507.20
402.63
262.96
7
Cr-24
595.56
510.86
410.65
290.77
8
Cr-30
591.15
507.20
405.28
265.55
Media +/- SD
586.84+/-7.7
504.96+/-3.8
403.44+/-5
268.62+/-9
N°
muestra
Tamaño molecular de los amplicones en pb
1
Cr-8
480.48
423.38
318.86
269.90
208.50
130.15
2
Cr-11
471.08
415.39
325.53
266.47
210.73
141.62
3
Cr-14
475.87
420.74
318.86
266.96
212.54
135.57
4
Cr-18
472.34
412.33
319.45
265.55
210.73
138.00
5
Cr-20
477.67
415.39
325.54
268.18
209.74
141.62
6
Cr-23
471.08
415.39
325.53
266.47
208.50
137.59
7
Cr-24
469.45
422.13
315.87
265.77
208.50
141.62
8
Cr-30
466.47
411.47
318.86
267.11
206.31
137.59
Media +/- SD
473+/-4.6
417+/-4.5
321+/-3.9
267.1+/-1.4
209.44+/-1.9
137.97+/-3.9
CANTUA Vol. 19 (1): 23-31 (2020). Versión Online ISSSN 2709-8817
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La enzima SacI no tiene sitio de restricción en el fragmento
analizado en las 31 secuencias descargadas, y lo mismo ocurre
en las reacciones de digestión con esta enzima en las 8 cepas
del género Bacillus. Por lo tanto, esta enzima no ayuda a
discriminar a las especies de este género.
La enzima HindIII no tiene sitio de restricción en las 8 cepas
CR y tampoco lo tiene en las especies B. amyloliquefaciens, B.
megaterium, B. coagulans, B. subtilis, B. pseudofirmus, B.
cellulosilyticus, B. antrophaeus, B. licheniformis, B. clausii, B.
stearothermophilus, B. infantis y B. pumilus (Fig. 6). Esta
enzima tiene un solo sitio de restricción en el fragmento del gen
rRNA 23S y genera dos fragmentos de corte de 492 pb y 1435
pb en las especies B. anthracis, B. mycoides, B. toyonensis, B.
weihenstephanensis, B. cytotoxicus, B. cereus y B. thuringiensis
(Fig. 6). Esta enzima realiza una buena discriminación, por lo
se puede indicar que las cepas CR pertenecen al primer grupo
donde no se encuentra sitio de restricción. El género Bacillus es
complejo desde el punto de vista bioquímico y genético, alberga
a muchas especies con características distintas por lo que su
filogenia y clasificación aún está en estudio, Bhandari (2013)
divide a las especies de Bacillus en dos clados, el clado subtilis
y el clado cereus, tomando en cuenta los resultados de
restricción se puede indicar que las cepas CR pertenecen al
clado subtilis, y descartamos la semejanza con las especies que
tienen un sitio de restricción. Este análisis ayuda a acotar la
similitud de las cepas CR a un grupo de cepas que no tienen
sitio de corte.
La enzima HaeIII produce un patrón de cortes más
complejo y está representado en la figura 7, se han establecido
6 patrones de corte en las 31 secuencias del NCBI analizadas,
el primer patrón consiste en 5 fragmentos de 600 pb, 512 pb,
398 pb, 269 pb y 148 pb y lo presentan las especies B.
amyloliquefaciens, B. anthracis, B. mycoides, B. toyonensis, B.
subtilis, B. cellulolyticus, B. antrophaeus, B.
weihenstephanensis, B. cytotoxicus, B. liqueniformis, B.
infantis, B. cereus, B. thuringiensis y B. pumilus, cabe indicar
que este patrón tiene la mayoría de las especies analizadas. El
segundo patrón consiste en los fragmentos de 600 pb, 378 pb,
289 pb, 148 pb, 299 pb, 202pb y 11 pb; en este patrón lo más
resaltante es que no existe el fragmento de 512 pb presente en
el primer patrón, y lo presentan accesiones de B. megaterium.
Cabe indicar que no tomamos en cuenta los fragmentos
pequeños porque no es posible visualizarlos en los geles de
agarosa. El tercer patrón lo conforman fragmentos de 600 pb,
512 pb, 271 pb, 148 pb, 257 pb, 127 pb y 12 pb; en este patrón
lo más resaltante es la ausencia del fragmento de 398 del primer
patrón, y B. coagulans es la única especie que sigue este patrón,
sin embargo, solo se analizó 1 cepa de esta especie. El cuarto
patrón de corte es el conjunto de fragmentos de 600 pb, 512 pb
y 815 pb y lo presenta la especie B. pseudofirmus. El quinto
patrón lo representan el conjunto de fragmentos de 600 pb, 546
pb, 269 pb, 201 pb y 311 pb; en este patrón no está el fragmento
de 398 pb presente en el primer patrón, y lo presenta la especie
B. clausii. El sexto patrón lo conforman fragmentos de 600 pb,
512 pb, 269 pb, 160 pb, 238 pb y 148 pb, y a diferencia del
primer patrón no presenta el fragmento de 398 pb y lo presenta
solo la especie B. stearothermophilus. Pasando a los cortes
obtenidos en las cepas CR, la enzima HaeIII produce 5
fragmentos de 578.18 pb, 500 pb, 396.54 pb, 262.46 pb y
162.34 pb; si realizamos la comparación de cortes y fragmentos
producidos, las cepas CR cumplen el primer patrón de corte, por
lo que estarían relacionadas con las especies que lo presentan.
Tabla 3. Relación de secuencias del gen rRNA 23S de cepas del género Bacillus reportadas en el NCBI. Se incluye el código de la
cepa y el número de acceso en el NCBI. nd: no hay dato.
Organismo
Cepa
Número de acceso
Bacillus amyloliquefaciens
M4-96
KU302815.1
Bacillus amyloliquefaciens
FZB42
NR076480
Bacillus anthracis
Sterne
AF267877
Bacillus anthracis
Ames
NR076205.1
Bacillus anthracis
Sterne
S43426.1
Bacillus mycoides
DSM 2048
AJ310097.1
Bacillus mycoides
nd
AF267884.1
Bacillus megaterium
QM B1551
NR076736.1
Bacillus megaterium
NCT-2
CP032527.2
Bacillus megaterium
ATCC 14581
JJMH1000054.1
Bacillus toyonensis
BCT-7112
NR121962.1
Bacillus coagulans
nd
NR03179.1
Bacillus subtilis
68
NR103037.1
Bacillus pseudofirmus
OF4
NR103029.1
Bacillus cellulosilyticus
N-4
NR096818.1
Bacillus atrophaeus
1942
NR076784.1
Bacillus weihenstephanensis
KBAB4
NR076551.1
Bacillus cytotoxicus
NVH 391-98
NR076523.1
Bacillus licheniformis
ATCC 14580
NR076345.1
Bacillus clausii
KSM-K16
NR 076255.1
Bacillus stearothermophilus
nd
X01387.1
Bacillus infantis
NRRL B-14911
NR 121950.1
Bacillus cereus
ATCC 14579
NR 076204.1
Bacillus cereus
nd
AJ310101.1
Bacillus cereus
ATCC 14893
AJ310099.1
Bacillus cereus
LMG 6923
AJ310096.1
Bacillus thuringiensis
nd
X89895.1
Bacillus thuringiensis
LMG 7138
AJ310738.1
Bacillus thuringiensis
VCRC B-17
MG745386.1
Bacillus pumilus
TUAT1
AP014928
Bacillus pumilus
SAFR-032
NE 076533.1
Quispe–Ricalde, et al.: marcadores moleculares, Bacillus
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Figura 6. Diagrama de los puntos de restricción de la enzima Hind III en las secuencias del gen rRNA 23S de 1927 pb. Cepas CR
indican las cepas utilizadas en este estudio y sometidas a digestión con la enzima Hind III. En cada secuencia analizada indica el
código de acceso seguido de la especie.
La enzima RsaI también produce un patrón de cortes complejo
en las secuencias de las 31 accesiones analizadas (Fig. 8). El
primer patrón discrimina 5 fragmentos de 467pb, 411pb, 323pb,
269pb, 209pb y lo presentan las especies B. amyloliquefaciens,
B. anthracis, B. mycoides, B. toyonensis, B. subtilis, B.
antrophaeus, B. weihenstephanensis, B. cytotoxicus, B.
liqueniformis, B. clausii, B. cereus, B. thuringiensis y B.
pumilus. El segundo patrón lo forman fragmentos de 467 pb,
411 pb, 323 pb, 269 pb, 149pb, 41 pb, 80pb, 85pb, 33pb, 9pb,
y 60pb; se consideran todos los fragmentos de las secuencias,
pero los fragmentos pequeños menores a 60 pb no se podrán ver
en los geles de agarosa. Lo resaltante del segundo patrón es la
falta del fragmento de 209 pb, y este patrón se observó en 2
cepas B. megaterium, la tercera secuencia de B. megaterium no
es completa, B. coagulans, B. pseudofirmus y B. infantis. El
tercer patrón de corte produce fragmentos de 323pb, 269pb,
149pb, 41pb, 85pb, 33pb, 9pb, 75pb, y 60 pb; este patrón
también está ausente el fragmento de 209pb, presente en el
primer patrón, y solo lo presenta B. cellulolyticus. El cuarto
patrón de corte produce fragmentos de 552pb, 411pb, 323pb,
269pb, 209 pb, 41pb, 89pb y 33pb; y lo presenta B. clausii. El
quinto patrón de corte resuelve los fragmentos de 500pb, 467pb,
323pb, 269pb, 209pb, 41pb, 85pb y 33pb; este patrón de corte
presenta la especie B. stearophilus. Los cortes con la enzima
CANTUA Vol. 19 (1): 23-31 (2020). Versión Online ISSSN 2709-8817
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RsaI que se observaron en los geles de agarosa y que
corresponden a las cepas CR son de 473pb, 417pb, 321pb,
267.1pb, 209pb y 137.9pb, ninguno de los cinco patrones de
corte resueltos de forma teórica, se corresponden con lo
observado en los geles; sin embargo, haciendo una homología
entre los tamaños producidos, las cepas del estudio se asemejan
más al primer patrón.
Realizando un descarte tomando en cuenta la presencia o
ausencia de algunos fragmentos, se deducen algunos candidatos
a los que podrían corresponder la identidad de las cepas CR, y
estas son B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. antrophaeus, B.
liqueniformis y B. pumilus. Todas estas especies pertenecen al
clado de B. subtilis, por lo tanto, las cepas CR pertenecen a este
clado.
Figura 7. Diagrama de los puntos de restricción de la enzima Hae III en las secuencias del gen rRNA 23S de 1927 pb. Cepas CR
indican las cepas utilizadas en este estudio y sometidas a digestión con la enzima Hae III. En cada secuencia analizada indica el
código de acceso seguido de la especie.
Quispe–Ricalde, et al.: marcadores moleculares, Bacillus
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Figura 8. Diagrama de los puntos de restricción de la enzima RsaI en las secuencias del gen rRNA 23S de 1927 pb. Cepas CR
indican las cepas utilizadas en este estudio y sometidas a digestión con la enzima RsaI. En cada secuencia analizada indica el
código de acceso seguido de la especie.
DISCUSIÓN
Son varios los trabajos de análisis de marcadores moleculares
para determinar la pertenencia al género Bacillus, y que además
se soportan para proponer la reorganización del género, debido
a la falta de una adecuada clasificación que ha permitido haya
subclasificaciones de especies en el género, que en varios casos
resultan repetitivos o con falta de características que las
mantengan en su clasificación (Fritze, 2004; Loga & De vos,
2009). Una de estas clasificaciones, después de un análisis
filogenético define la división de las especies en dos clados, el
clado de B. subtilis y el clado de B. cereus, lo resaltante de esta
división es que el clado de B. cereus contiene varias especies de
importancia clínica, lo cual debería de tomarse en cuenta como
característica fenotípica que da soporte a esta separación. Las 8
cepas analizadas dentro del marco de los fragmentos de
restricción originados por las respectivas enzimas, indica que
las cepas podrían pertenecer al clado de B. subtilis, más aún
porque se trata de bacterias que han sido obtenidas a partir de
residuos de la industria de curtiembre, es decir son muestras
ambientales. Después de realizar la aproximación a las
identidades por comparación de los patrones de corte,
CANTUA Vol. 19 (1): 23-31 (2020). Versión Online ISSSN 2709-8817
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concluimos en que solo puede aproximar al subgrupo clado de
B. subtilis, con un grupo de especies posibles, la mejora de estos
resultados estaría relacionado al uso de más enzimas de
restricción y la búsqueda de nuevos patrones moleculares. Sin
duda la secuenciación del gen rRNA 23S conjuntamente con el
gen rRNA 16S y otros marcadores moleculares como
secuencias de proteínas concatenadas (Bhandari, 2013;
Zouzheng, 2009.) deben ir en conjunto para determinar la
identidad de los aislamientos de cepas de Bacillus tanto a nivel
clínico como de aislados ambientales, sin embargo, en aquellas
regiones del mundo donde la tecnología moderna no está al
alcance, la definición de algunos marcadores moleculares ya
sea RFLP u otro, son un soporte para poder realizar estudios de
aislamiento e identificación bacteriana.
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Presentado: 01/02/2024
Aceptado: 12/03/2024
Publicado: 18/03/2024