OBTENCIÓN NO CROMATOGRÁFICA
DEL ÁCIDO ROSMARÍNICO A PARTIR
DE UNA PLANTA MEDICINAL PERUANA:
lepechinia meyenii walp.Epling
(Lamiaceae) "Puna salvia"
Susan Fajardo Canal, Ana Lechuga Chacón, Celina Luizar Obregón, Carlos Serrano
Flores, Mijail Cjuno Quispe, Jorge Choquenaira Parí y Janet Gonzales Bellido,
Con el propósito de evaluar la actividad
antioxidante de las especies sur andinas de la
Tribu Mentheae (Nepetoideae, Lamiaceae) se hizo
necesario disponer de pequeñas cantidades de
ácido rosmarínico con fines de comparación.
La especie de partida para tal fin no es un
representante de las especies europeas como serían
el romero (Rosmarinus officinalis) o el toronjil
(Melissa officinalis) que, como se sabe, contienen
esta sustancia. En realidad la quimiotaxonomía
indica que podríamos obtener ácido rosmarínico
de cualquier representante de la tribu Mentheae
(1); algunos ejemplos tomados de la flora medicinal
del Cusco (2), (3), aparecen en la tabla 1:
Se eligió a Lepechinia meyenii por ser conocida
en Cusco como Puna Sabia y tener uso medicinal
muy difundido. Incluso, un estudio hecho para
la provincia de Espinar muestra que esta planta
medicinal es la tercera en ser utilizada por los
pobladores (4).
Además, porque en un trabajo anterior
(5) se mostró la composición del aceite esencial
de esta planta, así como la presencia de ácido
rosmarínico y cafeico por cromatografía de capa
fina y espectroscopia UV, tanto como la actividad
antioxidante por el método del azul de molibdeno.
100 (xg de extracto acuoso y metanólico son tan
antioxidantes como 22.73 y 20.57 pg de vitamina
C, respectivamente (6).
De manera que para evaluar la actividad
antioxidante y el contenido de ácido rosmarínico
en las especies cusqueñas de la tribu Mentheae,
hay que disponer el patrón de ácido rosmarínico
que se va a obtener a partir de Lepechinia meyenii.
PARTE EXPERIMENTAL
Para purificar el ácido rosmarínico a partir
de L. meyenii, se tuvo en cuenta el trabajo original
de Scarpati, tomado de la referencia (7) y también
de las referencias (8) para la extracción;(9) para el
sistema de cromatografía en capa fina; (10) para la
cromatografía en columna de Si Gel; (11) y (12) para
los espectros UV y (8), y (13) para la espectroscopia
IR. Hay que advertir que el aislamiento y síntesis
Tabla N° 1. Plantas medicinales cusqueñas que
pertenecen a la subfamilia.
•
Hedeoma andonianum • Origanum majorana
• Hyptis mutabilis • Origanum vulgare
• Melissa
officinalis
• Rosmarinus officinalis
• Mentha viridis
• Salvia dombeyii
• Minthostachys andina • Salvia oppositiflora
• Minthostachys setosa
• Satureja boliviana
• Ocimum basilicum • Satureja nubígena
• Ocimum micranthum • Sphacele tenuiflora
(sin. Lepechinia eyenü)
Figura A'" 1.
Lepechinia meyenii en Tambomachay
a 3700 msnm.
— REVISTA UNIVERSITARIA 141 —
purificó AR cromatográficamente y también
no cromatográficamente. El primer método,
cromatográfico, da un producto más puro, 0.58%
respecto al peso de planta seca. El segundo método,
sacrificando un poco la pureza, permite obtener a
menos costo esta sustancia en un 0.68%.
Sin embargo, el último método, de posible
aplicación tecnológica, implicaba particiones con
NaHC03 al 5% (pH 10) y luego acidificación,
que podría afectar la sustancia -disminuyendo el
rendimiento. La lectura de (16) y el cálculo de log
D sugerían que este juego de particiones podría
arreglarse y hacer un método aún más simple. De
eso trata este trabajo.
PROCEDIMIENTO
104 g de hojas de Lepechinia meyenii
desmenuzadas, se maceraron primero con 2L de
agua hirviente por 24 hrs. y luego con 1L más de
agua hirviente, por igual tiempo. Los extractos se
filtran por algodón, se juntan y se ponen a pH 2.37.
Este extracto acuoso ácido se reparte con varias
porciones de acetato de etilo. El residuo acuoso se
desecha y la fase orgánica se deseca con MgS04;
luego se evapora a sequedad a 40°C.
El extracto de AcOEt se disuelve en agua
caliente y se hace enfriar por 12 horas a 4
o
C,
con lo que precipita una sustancia resinosa que
se desecha. El líquido claro sobrenadante cuyo
pH es 2.89, se extrae repetidamente con Et ,0. El
Figura N° 2. El log D del ácido rosmarínico simulado con ACD 6 (18).
LogO del ácido rosmarínico
del ácido rosmarínico no es una historia terminada
y así lo demuestran las referencias (14), (15) y (16).
El ácido rosmarínico tiene la siguiente
estructura:
Es una molécula soluble en agua, etanol,
metanol, acetato de etilo y en menor proporción
en dietil éter. Conviene averiguarle su logD. El
logP se define por:
logP = log[HA]_
ol
/[HA]
H20
y muestra cuán lipofilico (mayor logP) es un soluto
a pH neutro. Para sustancias ionizables, es mejor
utilizar el log D. El log D para una sustancia ácida
se define por:
D = [HA]
o
+ [A-]/ [HA]
H20+
[A-]
H20
que muestra la lipoficilicidad del ácido en todo el
rango de pH. El gráfico de logD (Figura 2) se ha
simulado utilizando el programa ACD6 (18).
Para el proceso de purificación se debe
tener en cuenta este comportamiento así
predicho. Así, en un trabajo anterior (19) se
• 100 AÑOS
Tabla N° 2. Datos espectroscopia« HNMR según
Wang (22) a 300 MHZ y en deuteroacetona.
• 5 3.03 (2H, m, H-7*)
• 8 5.20 (lH,m, H-8')
•86.29(1H, d,J = 16 Hz, H-8)
•t 6.61-6.87 (4H, m, H-5, H-2', H-5', H-6')
• 5 7.03 (1H, dd,J= 8 Hz, 2 Hz, H-6)
• 5 7.16 (1H, d,J=2Hz, H-2)
• 8 7.55 (1H, d,J =
16
Hz, H-7)
FeClj al 5% como revelador el AR tiene un Rf de
0.15, tal como se describe en (9).
Figura 3. El espectro corresponde a las 143
descripciones publicadas en (11) y (12).
Figura 4. También el espectro infrarrojo se
muestra como los de la literatura (20), (21).
Figura 5. Comparando nuestros resultados
espectroscópicos con aquéllos descritos en (22) se
observa gran concordancia de señales. En esta
referencia, la numeración de los carbonos en el
AR aparece en la figura 6.
Los datos espectroscópicos de RMN muestran
un ácido rosmarínico puro con agua de constitución
incluida que aparece en el pico HNMR a 3.38
ppm, porque la sustancia está precipitada de agua
precisamente. Lepechinia meyenii es una buena
materia prima para hacer AR porque el contenido
fenólico de esta planta es prácticamente solo AR (5).
Figura N° 4. Espectro infrarrojo.
Número de Ondas (cm-1)
Figura N° 3. Espectro Ultravioleta: Se observan 2
máximos a 292 y 331 nm.
1-1
1-0
\
0-9
\
0-8
\ 331.00
0-2
\ /\
js 0-6
o
\ 292£0/ \
| 0-5
\ / \
|
04
\ / \
0-3 \J \
0-2
\
0-1
425.00
0-0
200 225 250 225 300 325 350 325 400 425 450 425 500
Lambda(nm)
extracto etéreo, luego de secarse y evaporarse a
sequedad se disuelve en el menor volumen posible
de agua caliente que por repetidos enfriamientos a
4° C y abandono en desecador con ácido sulfúrico,
precipita finalmente un sólido amarillo que se lava
con agua helada y se deseca sobre ácido sulfúrico,
obteniéndose 2.55 g de un sólido crema -2.5% de
rendimiento— que es el ácido rosmarínico.
Caracterización del ácido rosmarínico
Cromatografía en capa fina: Utilizando
cromatoplacas de SiGelG 60, como líquido
desarrollador C
()
H
6
: AcOEt:HCQ
2
H (36:12:5) y
— REVISTA UNIVERSITARIA 141 —
Figura N° 5. Espectros de RMN.
1» K.i. (COKSl K DM54-34
144
i sss«353:¡sss::?ií
J523üts.-.nsas*
S.8S**8*SSSS»*
»3 StWt*
£ *
ÌÌ íí
I I I
i li
,1
i!
JUL JK.
Y Y Y i
I
I ' }
A~Aj
Vi
zi
12
5* íluai:
v/í W w
' h i
11
1
i.| ¡.
! ¡
. íi
t
v
" !
V V
Vf
..j '
i L.
•I "I
1
JK ».». «A-ÍSEI ra mii-n
s 9
il
\W/
! í ! S
ti t z
i | '
SIII**3SI
'Ww
S » J »
?m s
U1
139 IH U*
i
A
!
I L
¡\mmrn
i «3 l» tst Ui i« H «« J® <3 59 M >S
• 100 AÑOS
Se dispone ahora de una sustancia
referencial para evaluaciones cuantitativas de
AR y actividad antioxidante en las plantas de la
tribu Mentheae. Además, es la primera vez que
se describe el aislamiento de esta sustancia para
esta especie. Dado el alto rendimiento en AR, el
presente método de obtención puede traducirse a
escala industrial.
INSTRUMENTACIÓN
El espectro UV fue determinado con el equipo
UV-Vis Evolution 300 de ThermoElectronics. El
espectro IR se tomó en un equipo Nicolet 380.
También de ThermoElectronics. Los espectros de
RMN se desarrollaron en un equipo Bruker AC300
de la Pontificia Universidad Católica del Perú.
Agradecimiento
A la UNSAAC, pues el presente trabajo es parte
del Proyecto FEDU 2007-2008. Componentes
Fenólicos de Plantas Cusqueñas de la Tribu
Mentheae (Nepetoideae, Lamiaceae). Al
laboratorio de RMN de PUCP donde, por los buenos
encargos de los profesores. Helena Maruenda y Alex
Nieva, se desarrollaron los espectros NMR durante
la II Conferencia Internacional Spectra 2009.
Figura N° 6. La
AR según (22).
numeración de los carbonos en el
0 O^OH ^4>0H
i'i Jr í I
XI
OH
C18H0s,360.31
Tabla N° 3. Datos espectroscópicos HNMR del
presente trabajo.
• 8
2.93 (2
H, m, H-7')
•85.02(lH,m, H-8')
•86.24(1 H, d„J= 15.9 Hz, H-8)
•
-8
6.50-6.77 (4H, m, H-5, H-2', H-5', H-6')
• 8 7.00 (1H, dd,J=7.5 Hz, 1.8 Hz, H-6)
• 8 7.05 (1H, d,J=1.8 Hz, H-2)
• 8 7.46 (lH,d,J = 15.9 Hz, H-7)
Tabla N° 4. Valores de^CNMR según Wang (22) a
75 MHz en deuteroacetona comparados con nuestros
valores también a 75 MHz pero en dDMSO.
Wang Carbono Presente trabajo
171.2
9'
170.913
166.8 9 165.979
149.0
4 148.665
146.5 3
145.985
146.3 7 145.632
145.7 3'
144.965
144.7
4'
144.045
129.1
V 127.323
127.3
1 125.370
122.7 6
121.654
121.6 6'
120.080
117.3 2'
116.714
116.3 5
115.788
115.5 5'
115.413
115.2 2
114.907
114.8 8
113.270
73.7 8'
72.891
37.4
7' 36.132
145
BIBLIOGRAFÍA
(1)
WINKM. et al.
2003. "Evolution of Secondary Metabolites from an
Ecological and Molecular Phylogenetic Perspective".
Phytochemistry, 64, 3-19.
(2) ROERSCH C. y VAN DER HOOGTE L.
1988. Plantas Medicinales del Sur Andino del Perú. Centro de
Medicina Andina.
(3) ROERSCH C.
1994. Plantas Mediánales del Sur Andino del Perú. Centro de
Medicina Andina.
(4) HAHOLD A. y KROEGER A.
1990. Superación de la Enfermedad en las Alturas de los Andes del
Perú.
Centro de Medicina Andina.
(5) FAJARDO S. VALENCIA A. SERRANO C.
2007. Estudio de la Composición y Actividad Antioxidante de
Lepechinia meyenii (Walp.) Epling (Lamiaceae). XXIII
Congreso Peruano de Química. Lima.
(6) PRIETO P. et al.
1999. "Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant
Capacity Through the Formation of a
Phosphomolybdenum Complex. Specific Application
to the Determination of Vitamin E". Analytical
Biochemistry 269, 337-341.
(7) ELLIS B. & TOWERS G.
1970. "Biogenesis of Rosmarinic Acid in Mentha"
BiochemicalJ.il
8,
291-297.
— REVISTA UNIVERSITARIA 141 —
(8) STAHLE.
1986. Isolierung und Charakterisierung von Naturstoffen Gustav
Fischer Verlag.
(9) BARICEVIC D. et al.
2001. "Topical anti-Inflammatory Activity of Salvia
Officinalis L. Leaves. The Relevance of Ursolic Acid".
J. Ethnopharmacology 75(2-3), 125-132.
(10) MOHAGHEGHZADEH A. et al.
2004. "Rosmarinic Acid from Zataria Multiflora Tops and in
Vitro Cultures". In: Fitoterapia 72, 315-321 .
(11) TRONCOSO N. y Col.
2005. "Fast HPLC and UV-Vis Quantification of Principal
Phenolic Antioxidants in Fresh Rosemary". J.
Chromatography A 1100, 20-25.
(12) "Wang H. et al. 2004. Determination of Rosmarinic
Acid and Caffeic Acid in Aromatic Herbs by HPLC".
Food Chemistry 87, 307-311.
(13) STEHFEST K. et al.
2004. "Fourier Transform IR as a New Tool to Determine
Rosmarinic Acid in Situ". J. Plant Physiology 161,151-156.
(14) PETERSEN M. & SIMMONDS M.
2003. "Rosmarinic Acid". In: Phytochemistry 62, 121-125.
(15) ZELIC B.et al.
2005. "Recovery and Purification of Rosmarinic Acid from
Rosemary Using Electrodialysis." In: Acta Chimica
Slov. 52, 126-130.
(16) BOYADZHIEV L. & DIMITROVA V.
2006. "Extraction and Liquid Membrane Preconcentration
of Rosmarinic Acid from Lemon Balm (Melissa
Officinalis L.)". In: Separation Science &Technology
4, 877-886.
(17) WAKSMUNDZKA-HAJNOS M., SHERMA J.
KOWALSKA T.
2008. TLC
CHromatography in Phytochemistry
CRC Press.
(18) www.acdlabs.com
(19) CJUNO M., CHOqUENAIRAJ, SERRANO C.
2009. "Separación del Acido Rosmarínico a partir de
Lepechinia Meyenii Walp.Epling (Lamiaceae)". En:
Revista de la Facultad de Ciencias Químicas, Físicas y
Matemáticas. UNSAAC N°l.
(20) NAJATANI N. & KIKUZAKI H.
1989. "Structure of a New Antioxidative Phenolic Acid
from Oregano (Origanum vulgare L.)" In: Agrie. Biol.
Chem. 53 (2), 519-24.
(21) ROLANDO A. Y GONZÁLEZ M.
2005. "Chemical study of Water Extract of Argentine
Comercial Origanum". In: J. Argentinian Chemical
Soc. 93 (4-6).
(22) WANG M. et al.
1998. "Antioxidative Phenolic Compounds from Sage (Salvia
officinalis)." In: J. Agricultural & Food Chemistry
46(12), 4869-4873.
