EFECTO DE LA INFLUENCIA
COMBINADA DE COLORANTES
INTERCALADORES - SENSIBILIZADORES
E IRRADIACIÓN DE LÁSERES
ULTRAVIOLETA EN EL ADN DEL MAÍZ
Jorge Acnrio Saavedra, Alfonso Aréstegui Pezúa,
Elena E. Madera Tupayachi, Julia G., Mnñiz Duran y Elena E. Acurio S.
INTRODUCCIÓN
Los láseres son denominados nuevas fuentes
de radiación óptica con una pequeña divergencia
angular, alto grado de coherencia y mono
cromatismo. Los diferentes tipos de láseres creados
en la actualidad trabajan en regímenes continuos
de impulso, suministran la generación de
radiación en diferentes longitudes de onda en los
diapasones espectrales (bandas) ultravioleta, visible
e infrarrojos. En los últimos años, el desarrollo
de la técnica de láseres despertó el interés para
la interacción de radiaciones coherentes y
monocromáticas con sistemas biológicos (Neidle,
etal. 1984).
Se conocen diferentes aspectos sobre la
acción biológica de la radiación con láseres; sin
embargo, en dichos trabajos la atención prestada
a los mecanismos de acción por la radiación
láser (RL) hacia objetos biológicos es insuficiente.
En este sentido, el objetivo del estudio fue
interpretar brevemente los antecedentes que se
tenían por bibliografía sobre la acción biológica
de las radiaciones láser y poner en evidencia la
probabilidad de formación de rupturas mono
y bihebradas en el ADN del maíz, que pueden
ser la causa de la acción mutagénica por la RL
y colorantes intercaladores-sensibilizadores en
plantas, mediante aislamiento y purificación del
ADN, irradiación con láser, espectrofotometría de
luz UV y visible y electroforesis en gel.
Se obtuvieron coleoptilos de maíz entre 3 y
4 cm de longitud y a partir de éstos se extrajeron y
purificaron volúmenes de ADN correspondientes a
1,5 gr del material; posteriormente, se sometieron
a RL las diferentes variantes en complejos ADN-
colorante intercalante (8-Methoxypsoralen u
8-MOP, Acridone y 6-Mercapthopurina o 6-MP) y
los respectivos casos de control. Luego de los datos
obtenidos mediante pruebas de espectrofotometría
y electroforesis se demostró que la variante
en complejo ADN-6MP, no siendo un buen
intercalador, alcanza un máximo efecto en la
formación de rupturas mono y bihebradas frente
a los complejos ADN-8MOP y ADN-Acridone en
las mismas condiciones y concentraciones.
OBJETIVOS:
• Inducir la formación de rupturas mono y
bihebradas en el ADN del maíz, por acción
combinada de colorantes intercaladores
- sensibilizadores e irradiación de láseres
ultravioleta.
Poner en evidencia la probabilidad de
formación de rupturas mono y bihebradas
en el ADN del coleoptilo del maíz por
efecto de la acción combinada de colorantes
intercaladores-sensibilizadores e irradiación
de láseres ultravioleta que pueden ser la
causa de la acción mutagénica en plantas.
HIPÓTESIS
La interacción de la RL con colorantes
intercaladores-sensibilizadores presentan un
impacto mutagénico en los sistemas biológicos,
los cuales pueden ser evaluados por técnicas que
permitan observar rupturas mono y bihebradas en
el ADN.
METODOLOGÍA
1. El aislamiento del ADN se realizó mediante
el mini-método descrito por Lyhtenshtain y
Draner, 1988.
• REVISTA UNIVERSITARIA 141
2. La radiación se efectuó con ayuda del láser
LGI-21.
Dosis de radiación 3,6.10"
3
J.
Intensidad-densidad de radiación 1,9.10
8
Wt/m.seg
Frecuencia 100 Hz.
Potencia del impulso 2,2 Wt.
Tiempo del impulso 9.10"
9
seg.
Tiempo de radiación 30 min.
3. La preparación de los geles de agarosa y
la corrida electroforética en condiciones
nativas y denaturantes se realizó por
protocolos universalmente admitidos
(Maniatis et al, 1982).
4. La tinción del ADN en geles de agarosa, se
realizó con el colorante fluorescente bromuro
de etidio.
5. El fotografiado se efectuó en luz ultravioleta
de paso (trans linker) y reflejado (cross linker).
La película Polaroid TG PE57 o 667 (3000
unid eg ASA) posee mayor sensibilidad.
6. Preparación de buffer: para la electroforesis
generalmente se emplean buffers (soluciones
de amortiguación), que contengan Tris-
acetato, Tris-borato o Tris-fosfato en
concentraciones de 50 mM y con un pH de
7,5-7,8. Generalmente se prepara en forma
de soluciones concentradas y se conserva a
temperatura ambiente.
7. La espectrofotometría se realizó en el
espectrofotómetro Specord UV VIS para
la obtención de espectros de absorción y
temperatura de fusión.
RESULTADOS
El ADN es portador de la información
genética, interactúa con muchos medicamentos,
sustancias cancerígenas y mutagénicas, así también
con diversos colorantes; la presencia de cuatro
cromóforos heterocíclicos aromáticos alargados
revela su característica particular (Chen; Benkovic
1983). Por cuanto el ADN juega un rol importante
en los mecanismos de autoreplicación y expresión
genética, su modificación por la interacción con
dichos compuestos, ejerce un fuerte efecto sobre el
metabolismo celular, la recombinación y grado de
mutación (Waring 1981; Berman; Young, 1981).
Todos estos aspectos mencionados anteriormente
acerca de los efectos por la interacción con tales
compuestos, despertaron gran interés para su
creciente estudio, especialmente en los últimos
15 años. Se descubrió la probabilidad de su
aplicación en la medicina y su amplia utilización
en laboratorios de investigación sobre la estructura
y funciones del ADN (Strachan; Read 2006).
En la actualidad, se sabe sobre los efectos
mutagénicos y de recombinación por la RL
(Volodin et al 1984; Burilkóv 1985). Sin embargo,
la utilización de la RL, así como de otros mutágenos
y recombinógenos conocidos, no permite
aproximarse a la solución del problema principal
de conocer el grado y espectro para generar
variaciones genéticas. Entre ellos, la solución del
último problema tendría gran importancia en la
aceleración de los procesos de selección, el estudio
de los mecanismos de recombinación genética y la
generación de mutaciones.
En relación a este hecho, realizamos los
trabajos de evaluación y revelación sobre la acción
mutagénica y recombinogénica de la RL en
combinación con los colorantes sensibilizadores
que se intercalan entre los pares de bases
nitrogenadas del ADN. La unión de los colorantes-
sensibilizadores ocurre por la periferia de la
molécula del ADN o mediante la intercalación
entre los pares de las bases adyacentes sin la
alteración del apareamiento de Watson y Crick.
La configuración estructural es normal; así
también, la alteración en los nucleótidos de los
ácidos nucleicos, se puede detectar y observar
por las variaciones en los espectros de absorción
ultravioleta (Fig 1). Estos espectros son muy
sensibles a las variaciones en la composición
química o en la configuración estructural espacial
Figura N° 1: Espectro ultravioleta del ADN de Maíz.
E
X,
Longitud de onda
(nm)
E,
Coeficiente de extinción
(C'j
de los nucleótidos y sus polímeros. Además, el
espectro ultravioleta depende del estado eléctrico
de las bases heterocíclicas y permite detectar
las modificaciones químicas por los efectos de
protonización o deprotonización de las bases
nitrogenadas. En general, con la inserción de las
moléculas aromáticas con un grosor de 3,4 Á,
el esquema global del apilamiento aromático o
fenólico (stacking) puede o no perturbarse. Sin
embargo, para que la intercalación tenga lugar, los
pares de bases deben abrirse y esto conlleva a la
alteración en la geometría (curvatura) del armazón
pentosa-fosfato y la alteración de la configuración
regular espiralada, traduciéndose en una
alteración de las propiedades físicas de la doble
espiral con la inserción en ellos de los colorantes
sensibilizadores que fácilmente se revela con ayuda
de los espectros de absorción ultravioleta de las
diferentes variantes en complejos (Figs. 2, 3). Si la
intercalación no procede, entonces no se produce
cambio en las propiedades físicas del ADN y
como consecuencia no se alterará sus espectros de
absorción ultravioleta (Fig. 4).
Uno de los parámetros que también
caracteriza a la doble espiral es su temperatura de
fusión Tm (temperatura melting). La formación
del stacking se acompaña con la disminución de la
absorción de luz ultravioleta (hipocromismo); por
lo tanto, cuando se observa el espectro de absorción
en esta zona es cómodo detectar la alteración y
destrucción de la doble espiral del ADN (fig. 5);
si incrementamos lentamente la temperatura
Figura
N° 3:
Espectro ultravioleta de variantes en complejo.
E
1.
Complejo ADN-Acridone
2. ADN
de
Maíz
3.
Acrídone
de la solución del ADN bi-hebrado, entonces a
una determinada temperatura se observará un
incremento brusco de la absorción, condicionado
por la destrucción de la estructura espiralada. El
punto medio de dicha conversión se denomina
temperatura de fusión (Tm). El incremento en
longitud de la cadena elevará, por consiguiente, el
peso molecular del ADN, la temperatura de fusión
se acrecienta y la curva de fusión se mostrará
más empinada, indicando un aumento en la
cooperatividad (Póbschke 1971:1989).
Figura
N° 2:
Espectro ultravioleta
de
variantes en complejo. Figura N°
4:
Espectro ultravioleta
de
variantes en complejo.
200 250
1. Complejo
ADN-8MOP
2.
ADN de Maíz
3. 8MOP
300 350 X;nm
/.
Complejo
ADN-8MOP
2. ADN
de
Maíz
3. 8MOP
350
— REVISTA UNIVERSITARIA 141 —
Figura N° 5: Temperatura de fusión del ADN de Maíz.
La Tm del ADN bi-hebrado se acrecienta no
solamente con el aumento de su longitud, sino con
el incremento de la fuerza iónica de la solución,
por el contenido del par G-C, con la intercalación
en este de diferentes colorantes-sensibilizadores
(Fig. 6). En caso de ausencia de intercalación la
temperatura de fusión no prospera (Fig. 7).
Sin embargo, el efecto de los colorantes
sensibilizadores no se limita a la intercalación en
el ADN. Su principal prescripción sirve como
intermediario en la transferencia de la energía
agitada hacia el armazón pentosa-fosfato de los
ácidos nucleicos. Por tal razón, la interacción
colorante-ADN puede ocurrir y por la periferia de
la molécula del ADN, por ejemplo, en la inserción
del colorante en el surco mayor del ADN bi-
hebrado (Waring 1981; Berman; Young 1981).
La posibilidad de inducción de rupturas
mono y bi-hebradas por efecto de irradiación
láser en complejo ADN-colorante en el diapasón
ultravioleta, fue demostrada todavía en los años de
1980 (Parjomenco et al, 1980). Las interrogantes
sobre la inducción de rupturas mono y bi-hebradas
utilizando diferentes colorantes en un aspecto
comparativo, no se hicieron esperar, siendo el
objetivo del presente trabajo.
La irradiación efectuada de los complejos
ADN-colorante permitió demostrar los efectos de
la acción de RL y colorantes-sensibilizadores sobre
la molécula de alto peso molecular del ADN de
Figura N°
6:
Temperatura de fusión del complejo ADN-8MOE
1,3
/
1,2
1,1
/
1,0
y
25 35 45 55 65
T,
Temperatura
° C
!
?5 85 95
T
;°
C
E,
Extinción
ET/E T,
Temperatura
° C E,
Extinción
ET/E
• 100 AÑOS
Figura N° 8: Corrida electroforctica del ADN de
Maíz y variantes, en condiciones nativas.
1 2 :< I 5 ti 7
n
IIÍ
9
HIMMI
1.
ADA irradiado
2. ADN
no irradiado
3.
Complejo
ADN6MP
no irradiado
4.
Complejo
ADN-6MP
irradiado
5.
Complejo ADN-Acridone no irradiado
6.
Complejo ADN-Acridone irradiado
7.
Complejo
ADN-MOP
rw irradiado
8.
Complejo
ADN-MOP
irradiado
Figura N° 9: Corrida electroforética del ADN de
Maíz y variantes, en condiciones de desnaturación.
1.
ADN irradiado
2. ADN no
irradiado
3.
Complejo
ADN-6MP
no irradiado
4.
Complejo
ADN-6MP
irradiado
5.
Complejo ADN-Acridone no irradiado
6.
Complejo ADN-Acridone irradiado
7.
Complejo
ADN-MOP
no irradiado
8.
Complejo
ADN-MOP
irradiado
131
coleoptilos del maíz (fig. 8, 9). Como se observa en
los datos obtenidos por electroforesis, en caso de la
acción combinada de RL y colorante, se alcanza
un máximo efecto en la formación de rupturas
mono y bi-hebradas, con esto el sensibilizador más
efectivo resultó la 6-Mercapthopurina.
En la comparación de los espectros de
absorción de la 6-Mercapthopurina (Fig. 4),
8-Methoxypsoralen y acridone, la diferencia
es clara: el máximo de absorción de la
6-Mercapthopurina prácticamente yace en la
región de emisión de láser, al mismo tiempo que
los máximos de absorción del 8-Methoxypsoralen
y Acridone están relativamente desplazados
de la longitud de onda que fue utilizada. No
siendo intercalador la 6-Mercapthopurina es
denominado el mejor sensibilizador y a causa de
ello conduce a la formación de un mayor número
de rupturas mono y bi-hebradas de la molécula
del ADN.
CONCLUSIONES
1. Experimentalmente fue demostrada la
posibilidad de formación de rupturas mono
y bi-hebradas en la molécula de alto peso
molecular del ADN del maíz, que puede ser
utilizado posteriormente para el aumento
del nivel y espectro de variación genética.
2. Con respecto a la acción combinada de RL
y colorante sensibilizador se puede esperar
la inducción de rupturas adicionales en el
ADN cromosómico in vivo, los cuales son
capaces de realizarse en los intercambios por
translocación y crossing-over; así también,
el surgimiento de diferentes mutaciones a
nivel molecular en el ADN que conducen
finalmente al incremento general de la
frecuencia y el espectro de variación
genética, siendo conocido como primera
fuente de variación hereditaria de todas las
formas de organismos vivos.
REVISTA UNIVERSITARIA 141
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