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Aislamiento y caracterización de la cepa de Laetiporus cf. sulphureus, proveniente
de plantaciones forestales de Eucalyptus globulus, del distrito de Yucay, Cusco,
Perú
Isolation and characterization of Laetiporus cf. sulphureus from forest plantations
of Eucalyptus globulus, from the Yucay district, Cusco, Peru
1,2 2,3
Mario Callalli Chancahuaña & María E. Holgado-Rojas
1
Hongos Perú. Av. Ejército B-12, Cusco, Perú. Email: biomar6@gmail.com
2
Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco, Av. De la Cultura 733 Cusco. Perú
3
Sociedad Botánica del Cusco. Av. De la Cultura 733 Cusco, Perú.
Resumen
Se realizó la colecta de Laetiporus cf. sulphureus a partir de troncos de Eucalyptus globulus L. en la localidad de
Yucay durante los meses de febrero y marzo del 2014 con la finalidad de aislar y obtener la cepa de este
poliporo cuyos basidiomas juveniles presentan propiedades alimenticias. Para la colecta se utilizó el método
aleatorio simple, seleccionando aquellos que presentaban las mejores características en cuanto a tamaño,
aspecto y textura, realizando el aislamiento a partir de un fragmento de pseudotejido en Agar Papa
Dextrosa (PDA) y Agar Extracto Malta (EMA), a 25 ± 1ºC bajo condiciones de completa oscuridad. La
caracterización macroscópica de la cepa se realizó en cuatro medios de cultivo PDA, EMA, HMA (Agar
Harina de Maíz) y MBC (Medio Basado en Cerveza), incubados a 17, 21 y 25°C, midiendo el diámetro de la
colonia cada 24 horas durante siete días. Para la obtención de basidiomas el inoculo fúngico fue cultivado en
sustrato lignocelulósico a base de aserrín de eucalipto en un 80%. Las mejores características se lograron en
la cepa L. sp-01, determinándose al HMA, EMA como los medios de cultivo más adecuados con 9.25 y 9.23
mm/día a 25°C respectivamente. Los cuerpos furctiferos se obtuvieron después de una incubación de seis
meses e inmersión en agua a temperatura ambiente (shock térmico) por 24 horas.
Palabras clave. Caracterización, Cusco-Perú, Eucalyptus, Laetiporus, Xilófago.
Abstract
The collection of Laetiporus cf. sulphureus from Eucalyptus globulus L. in Yucay locality, was carried out
during the months of February and March 2014 with the purpose of isolating and obtaining the strain of this
polypore who's juvenile basidiomas have nutritional properties. For the collection, the simple random
method was used, selecting those basidiomas that presented the best characteristics in terms of size,
appearance and texture. The strain was isolated from a pseudo-tissue fragment by culturing on Potato
Dextrose Agar (PDA) and Malt Extract Agar (EMA), at 25 ± 1 °C under conditions of complete darkness.
Subsequently, the macroscopic characterization of the strain was carried out in four culture media PDA,
EMA, Corn Flour Agar (HMA) and Beer-Based Medium (MBC), incubated at 17, 21 and 25 ° C, measuring
the diameter of the colony every 24 hours for seven days. To obtain basidiomas, the fungal inoculum was
cultured in 80% lignocellulosic substrate based on eucalyptus sawdust. The best characteristics were
achieved in the L. sp-01 strain, determining HMA, EMA as the most suitable culture media with 9.25 and
9.23 mm / day at 25 ° C respectively. Fruiting bodies were obtained after a six-month of incubation and
immersion in water at room temperature (thermal shock) for 24 hours.
Keywords. Characterization, Cusco-Peru, Eucalyptus, Laetiporus, Xilofago.
Rev. Q'EUÑA 9 (2): 25 - 36 (Diciembre 2018)
ISSN: 2412-2297 (Imp)
Sociedad Botánica del Cusco
Recibido: Mayo 20, 2018
Aceptado: Noviembre 20, 2018
Callalli et al.: Aislamiento y caracterización de cepa de Laetiporus cf. sulphureus, de plantaciones de Eucalyptus globulus
Rev. Q'EUÑA 9 (2): 26 (Diciembre 2018)
Sociedad Botánica del Cusco
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Introducción
El cultivo de los hongos comestibles en la
actualidad se ha presentado como una
alternativa ideal para la obtención de alimentos
sobre todo en países en vías de desarrollo, siendo
fundamental en esta biotecnología el
aislamiento y culturización de las especies
reportadas como comestibles, donde la
velocidad del crecimiento micelial es
determinante para la elección de la cepa.
(Lopez-Rodriguez et al., 2008). En países
micofilicos como México esta actividad
promueve beneficios económicos, ecológicos y
s o c i a l e s (M a r t í n e z - C a r re r a , 20 0 2 ) .
Actualmente, la mayoría de las cepas utilizadas
en el cultivo comercial provienen de regiones de
América del Norte, Europa y el sur de Asia, las
q u e s o n m a n t e n i d a s b a j o m é t o d o s
convencionales para su preservación y
utilización en investigaciones orientadas a su
cultivo (Mata, Salmones, & Gaitán-Hernández,
2010). Especies de Agaricus, Pleurotus, Lentinula y
Ganoderma, se producen en mayor o menor
grado en diversas partes del mundo (Chang &
Quimio, 1982). Otras especies menos
conocidas son Neolentinus, Volvariella, Auricularia,
Flammulina, Grifola, Hypsizigus, Lepista y Morchella
(Martínez-Carrera, 2002; Mata et al., 2010).
Flammulina mexicana Redhead, Estrada, &
Petersen en (Franco et al., 2012) entre los que
se encuentra Laetiporus. Diversos autores han
demostrado la capacidad de estos hongos para
colonizar una gran variedad de sustratos
lignocelulósicos, caracterizando las etapas de
crecimiento micelial y producción de
carpóforos.
Esta capacidad de colonización del sustrato
depende de la calidad de cepa obtenida y
principalmente la velocidad de crecimiento del
micelio. Al respecto Holgado (2012) evalúa el
crecimiento micelial de Pleurotus ostreatus y P.
djamor en Medio Basado en Cerveza (MBC) con
Tasas de crecimiento Diario (TCD) de 12,43 y
6,14 mm/día. Mientras que para Pycnoporus
sanguineus (L: Fr) Murr. el medio EMA fue el
más adecuado con una velocidad de
crecimiento de 11.7 mm/día a 25°C. (Bautista
& Sánchez, 2011). Lo que también se viene
desarrollando en el CIPHAM de la UNSAAC.
Por lo que es necesario fortalecer el
desarrollo de la fungicultura aplicando
biotecnologías amigables con el ambiente
como los residuos lignocelulósicos que se
producen en la región como una alternativa
agroecológica de desarrollo sostenible y la
consecuente incorporación de nuevos
alimentos en la dieta del poblador andino. De
aquí la imperante necesidad de realizar estudios
encaminados a la obtención, caracterización y
aprovechamiento del germoplasma propio de
la región, que generen técnicas adecuadas para
la explotación masiva de los hongos
comestibles, más aún si tomamos en cuenta que
hasta ahora, se ha prestado poca atención a
cepas de origen mesoandino, particularmente
del orden de los poliporaceos.
Por consiguiente, evaluar el aislamiento y
cultivo de Laetiporus cf. sulphureus, en diferentes
medios de cultivo sólidos para obtener la cepa,
permitirá que este hongo xilófago promisorio,
sea considerado como un micorecurso
nutraceutico cuyo estudio aún no se ha
registrado en Perú.
Materiales y Métodos
Área de estudio
El ámbito de estudio comprende el distrito
de Yucay que se encuentra a 2 858 msnm a 78
km. de la Ciudad del Cusco en el Valle Sagrado
de los Incas.
Cuyas coordenadas UTM corresponde a
13°19'10” S y 72°05´10” W, limitando por el
Norte con la provincia de Calca, por el Sur con
el Distrito de Ollantaytambo, por el Este con el
Distrito de Chinchero y por el oeste con la
Comunidad de San Juan.
Metodología
O b t e n c i ó n d e b a s i d i o m a s y
determinación de los especímenes
silvestres
Los basidiomas fueron colectados por el
método aleatorio simple seleccionando
aq ue l lo s q ue pre s e n ta n l as me jo re s
características en cuanto a tamaño, aspecto y
textura (Mostajo, 2004), los cuales fueron
extraídos de forofitos de E. globulus con la ayuda
de una navaja estéril, en seguida colocados en
frascos de vidrio estériles y transportados al
Centro de Investigación y Producción de
Hongos Alimenticios y Medicinales (CIPHAM),
para sus posteriores evaluaciones.
Para la determinación de la especie se tomó
en cuenta los caracteres macroscópicos y
microscópicos, como la perennidad, tamaño del
Píleo, coloración, forma de margen,
consistencia, textura de la superficie, forma de
los basidios, tamaño y forma de esporas, tipos de
hifas, tipo de himenóforo y forma de poros.
Asimismo, se utilizó bibliografía especializada,
claves dicotómicas y consulta a especialistas.
Aislamiento y obtención de cepas de
Laetiporus cf. sulphureus, a partir de
tejido vegetativo
Se utilizó la metodología adaptada de
Saldarriaga Osorio & Pineda Gutiérrez (2001),
los basidiomas fueron seleccionados tomando
en cuenta el tamaño y el grado de desarrollo,
prefiriendo los juveniles, los mismos que
fueron desinfectados en una solución de
hipoclorito de sodio al 0.5% durante 5
minutos. Se realizaron enjuagues con agua
destilada estéril por tres veces. Luego se tomó
una pequeña porción de pseudotejido (4-5
mm) mediante cortes con bisturí de primer
uso. Los fragmentos se colocaron en placas
Petri con medios de cultivo: Agar Papa
Dextrosa (PDA) y Agar Extracto Malta (EMA).
La incubación se realizó a 25 ± 1ºC, previa
rotulación, observándose diariamente el
crecimiento de hifas y la formación del micelio.
Finalmente se obtuvo el micelio puro (cepa
madre) realizando un repique a partir de las
placas con las mejores características de
crecimiento.
Evaluación de la velocidad de
crecimiento micelial
Se tomó una pequeña fracción de la cepa
madre (agar con micelio de 10 mm de
diámetro) que se colocó en el centro de placas
Petri con medios de cultivo: Agar Papa
Dextrosa (PDA), Agar Extracto Malta (EMA),
Agar Harina de Maíz (HMA) y Medio Basado
en Cerveza (MBC), los cuales fueron incubados
a 17, 21 y 25ºC midiéndose el crecimiento
micelial durante 7 días con la ayuda de un
vernier. La velocidad de crecimiento se calculó
con la fórmula utilizada por Huerta, Martínez-
Carrera, Sánchez y Leal-Lara (2009):
Velocidad crecimiento = (Df - Di) / (Tf - Ti)
Dónde:
Df = Diámetro final de crecimiento
Di = Diámetro inicial de crecimiento
Tf-Ti = Días de crecimiento micelial
Callalli et al.: Aislamiento y caracterización de cepa de Laetiporus cf. sulphureus, de plantaciones de Eucalyptus globulus
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Rev. Q'EUÑA 9 (2): 27 (Diciembre 2018)
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Rev. Q'EUÑA 9 (2): 28 (Diciembre 2018)
Sociedad Botánica del Cusco
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Cultivo de Laetiporus cf. sulphureus.
Se utilizaron formulaciones de aserrín de
eucalipto (E. globulus), suplementado con
salvado de trigo (T. aestivum), tomando como
referencia lo utilizado por diferentes autores
para el cultivo de Ganoderma (Tabla 1).
Fuente: Chen (1999)
*cantidad de agua necesaria.
Inoculación e incubación del sustrato
final
La inoculación se realizó en condiciones de
asepsia, con un promedio de 30 gr. de spawn o
inoculo fúngico para cada bolsa, conteniendo
1.5 kilogramos de sustrato previamente
esterilizada. Durante la incubación se utilizaron
ambientes cerrados a 25ºC±1 sin iluminación
(Deacon, 2006) hasta que los sustratos
estuvieron completamente invadidos por el
micelio. La induccn a la fructificación se
realizó por inmersión en agua durante 24 horas
(Stamets, 1993), a temperatura ambiente.
Monitoreo de los parámetros
ambientales
Los parámetros a controlar fueron: la
temperatura y la humedad que se mantuvo a
través del riego diario por aspersión (ambos
- p a r á m e t r o s r e g i s t r a d o s p o r u n
termohigrómetro), oxigenación (ventilación
natural, por ventanas) y horas de luz natural.
Tratamiento Estadístico
La determinación de la calidad del
aislamiento se definió mediante el uso del
análisis de tabla cruzada. En tanto para las
velocidades de crecimiento se aplico ANOVA.
La prueba de Tuckey para determinar el
mejor medio de cultivo y la interacción. Los
análisis estadísticos y gráficos fueron realizados
mediante el uso del software de IBM-SPSS
Statistics y Excel. Donde se plantea la hipótesis
nula (H ) todos los tratamientos tienen medias
0
iguales, en tanto la hipótesis alterna (H ), no
1
todos los tratamientos tienen medias iguales.
Resultados y discusión
Desc r i pción macro s c ó p i c a y
microscópica de Laetiporus cf .
sulphureus
Basidioma, gregario, imbricado, anual, sésil,
moderadamente adherido al sustrato,
semicircular, hasta 18 cm de largo, 13 cm de
ancho y 5 cm de altura. Superficie abhimenial:
velutinosa finamente, lisa, glabra, de color
naranja intenso, que al madurar se decolora
bajando de intensidad, con margen lobulado de
color amarillo azufre. Superficie himenial:
Aserrín
Salvado
Suplemen to
CaSO4 2 H2O
H2O
Referencias
80%
18%
sacarosa 1%
1%
67%
Chen y Miles, 1996b
80%
20%
-
un poco
70%
Hseu, 1993
78%
20%
-
2%
*
Liu et al., 1990
75%
25%
-
-
*
Lu y Chang, 1975,
Quimio, 1986
87%
10%
-
3%
*
Tong y Chen, 1990
93,50%
5%
MgSO4 0,2 %
-
*
Triratana et al., 1991
Tabla 1. Formulaciones de sustratos utilizados para fructificación de Ganoderma lucidum, adaptado
para el cultivo de Laetiporus cf. sulphureus
finamente poroide, concoloro al margen que
al ser manipuladas se torna de color café oscuro,
con poros circulares. Contexto: carnosa,
homogéneo de color blanco. Impronta: blanca.
Sistema hifal: dimítico, hifas generativas de pared
simple, delgada, hialinas, ramificadas, con
septos simples; hifas esqueletales, hialinas, de
pared simple. Basidios: hialinas de pared delgada,
en forma de bate y/o clava, con el extremo
proximal (base) delgado y el extremo distal
(ápice) más ensanchada. Esporas: 3-5 um,
hialinas, elipsoidales, de pared delgada,
nucleadas. Hábitat: parásito, saprófito, lignícola,
en plantaciones forestales sobre corteza y
troncos de Eucalyptus globulus L. en pie y caídos
(Fig.1).
Aislamiento a partir de pseudotejido
La Tabla 2, muestra el grado de desarrollo del
micelio a los siete días, en diferentes medios de
cultivo observándose que todos los aislamientos
resultaron positivos. Así las cepas L. sp-04, L.
sp-05, L. sp-06 y L. sp-02 presentan
crecimiento regular, L. sp-03 presenta
crecimiento bueno, mientras L.sp-01 presenta
un crecimiento excelente y mejores
características de adaptación, el cual fue
utilizado como cepa madre para las siguientes
pruebas (Fig.2, 3).
+ : Regular, ++: Buena, +++ : Excelente
La Tabla 3, muestra el recuento de los
aislamientos positivos por cada medio de
cultivo y la calidad del grado de desarrollo de
las mismas, la que se determinó a través de
datos cualitativos, siendo estas clasificadas en
escala del 0 a 4, donde 0: no presenta
crecimiento micelial, 1: crecimiento regular, 2:
crecimiento bueno y 3: crecimiento Excelente.
Tabla 3. Tabla cruzada de recuento y
porcentaje esperado del medio de cultivo y
crecimiento micelial.
Selección del medio de cultivo sólido
óptimo para la propagación del micelio
vegetativo del hongo Laetiporus cf.
sulphureus
El crecimiento micelial (Tabla 4 y Fig. 2) de
la cepa L.sp.01, se evaluó a tres temperaturas
distintas: 17ºC, 21ºC y 25ºC, en cuatro medios
sólidos de cultivo: PDA, EMA, HMA y MBC, a
través de una correlación entre las variables
temperatura y medio de cultivo en relación el
diámetro de crecimiento micelial, siendo este
significativo.
Mediante el análisis de varianza (ANOVA)
se corroboró las diferencias significativas en las
medias para la variable medio de cultivo (Tabla
6) y temperatura (Tabla 7) encontrándose que
la velocidad de crecimiento micelial de L.sp-01
Callalli et al.: Aislamiento y caracterización de cepa de Laetiporus cf. sulphureus, de plantaciones de Eucalyptus globulus
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Rev. Q'EUÑA 9 (2): 29 (Diciembre 2018)
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Medio de
cultivo
Repeticiones
digo
Crecimiento
micelial
EMA
A
L.sp-01
+++
B
L.sp-02
+
C
L.sp-03
++
PDA
A
L.sp-04
+
B
L.sp-05
+
C
L.sp-06
+
Tabla 2. Grado del desarrollo micelial de
Laetiporus cf. sulphureus, durante el aislamiento.
Medio
de
cultivo
Crecimiento micelial
Total
Regular
Buena
Excelente
EMA
Recuento
1
1
1
3
% del
total
2.0
0.5
0.5
3.0
PDA
Recuento
3
0
0
3
% del
total
2.0
0.5
0.5
3.0
Total
Recuento
4
1
1
6
% del
total
4.0
1.0
1.0
6.0